A genomic exploration of transmissibility in Mycobacterium tuberculosis

Tese de Doutoramento em Ciências da Saúde.
The ability of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to be transmitted from host to host is not well understood. Previous molecular epidemiology studies have shown that while some clinical strains of Mtb are able to cause infection and disease in a large number of individuals exposed to them, others are confined in their transmission, despite the ample chance for the spread of the infection. Since preventing transmission of Mtb is the key to a continued decline in tuberculosis cases, understanding the host and bacterial factors that are associated with transmissibility could be useful in developing strategies to prevent transmission. Previous work has focused on cluster size as a measurable proxy for transmissibility, and several studies have found that host risk factors are associated with clustering and cluster size. This thesis set out to explore if and what bacterial factors, such as phylogenetic lineage and genomic markers, lie behind an increased transmissibility phenotype. We describe a novel approach, called the Propensity to Propagate (PPP), with which to adjust for host risk factors when quantifying transmissibility. Using this method, we found no significant differences to propagate between four different lineages within the Netherlands, as measured by molecular-typing defined cluster sizes. When looking more specifically at infectivity (as defined by mean number of positive contacts around each patient) and number of secondary cases within two years after diagnosis of an index case sharing the same fingerprint, we found evidence of phylogenetic lineage influencing these two indicators, namely, a decreased ability to infect and a lower secondary case rate in ancient phylogenetic lineages (Mycobacterium africanum and EAI) compared to their modern counterparts (Euro-American, Beijing, and CAS). One simple approach to discovering more specific genetic regions behind transmissibility involves checking the absence/presence of mutations in the genes of interest between transmissible and nontransmissible phenotypes. In one of our studies, a multivariate logistic regression-based analysis of patient-, microorganism- and disease-related factors failed to reveal any significant association between frameshift-causing indels in Mycobacterium cyclase/LuxR-like genes (mclxs) and transmissibility. Finally, using a large, well-characterized, complete data set of typed strains to identify strains found in large clusters as a proxy for a transmission phenotype as well as related strains that have not been transmitted, we selected 100 bacterial isolates after controlling for epidemiologic and host factors that may influence transmission. After whole genome sequencing, we subjected them to evolutionary convergence analysis. We identified six bacterial DNA regions - espE, PE-PGRS33, PE-PGRS56, Rv0197, Rv2813-14c and Rv2815-16c - to be associated with Mtb transmission and validated these regions by studying the response of human white blood cells to extracts from a subset of the tuberculosis bacteria that carried or did not carry mutations in these DNA regions. We show that there are differences in the immune response – as reflected by in vitro monocyte and T-cell cytokine production, reactive oxygen species release and neutrophil apoptosis - that associate with these genetic changes. These findings not only contribute to our understanding of the interplay of bacterial factors in creating more successful strains at transmitting, but also have implications in the future of disease surveillance and curbing of transmission, by providing for instance tools with which to flag patients carrying particularly transmissible strains.
A forma com que a bacteria Mycobacterium tuberculosis (Mtb) é transmitida de um hospedeiro para outro não está ainda bem estudada. Estudos de epidemiologia molecular têm demonstrado que, enquanto que algumas estirpes de Mtb tendem a causar infecção e doença num grande número de indivíduos, sugerindo uma grande capacidade de transmissão entre estes, outras apresentam uma propagação restrita, independentemente de terem elevadas oportunidades de disseminação. Uma vez que a prevenção da transmissão da Mtb é fundamental para o declínio continuado da tuberculose, o estudo dos fatores bacterianos que estão associados à transmissibilidade poderá ser útil para o desenvolvimento de novas estratégias de controlo da tuberculose. Trabalhos anteriores focaram-se no tamanho dos clusters como medida de transmissibilidade, e vários estudos demonstraram uma associação entre os fatores de risco do hospedeiro e o agrupamento e tamanho dos clusters. Nesta foi explorada a existência de fatores bacterianos, tais como linhagem filogenética ou marcadores genéticos, responsáveis por um fenótipo de maior ou menor transmissibilidade. Descrevemos assim uma nova abordagem, chamada propensão para propagar (PPP), com a qual é possível corrigir o viés dos factores de risco do hospedeiro na quantificação da transmissibilidade de uma estirpe. Ao aplicar este método não foi possível detectar diferenças significativas de propagação - considerando o tamanho de clusters definidos por tipagem molecular - entre quatro linhagens diferentes presentes na Holanda. Mas uma análise específica da capacidade de infetar (definida pelo número médio de contatos positivos de cada doente) e do número de casos secundários, no espaço de dois anos após o diagnóstico de um caso índice com o mesmo perfil genético, determinou que a linhagem filogenética influencia estes dois indicadores. Concretamente, as linhagens filogenéticas mais antigas (Mycobacterium africanum e EAI) apresentam uma menor capacidade de infectar e um menor número de casos secundários quando comparadas com as suas equivalentes modernas (Euro-Americano, Beijing, e CAS). Uma abordagem simples para identificar regiões genéticas específicas responsáveis pelas diferenças na transmissibilidade das estirpes envolve a análise da distribuição de mutações nos genes de interesse entre o fenótipo transmissível e o não-transmissível. Neste sentido uma análise baseada em regressão logística multivariada de fatores relacionados com o doente, o microorganismo ou a doença, não revelou qualquer associação significativa entre frameshift-causing indels (a presença de inserções ou deleções nucleotídicas causando a interrupção precoce da grelha de leitura dos genes) em genes Mycobacterium ciclase / LuxR-like (mclxs) e a transmissibilidade. Finalmente, uma grande coleção de isolados bem caracterizados e sujeitos a tipagem molecular foi usada para identificar estirpes pertencentes a clusters grandes - representativas de um fenótipo de transmissão elevada - bem como estirpes com propagação limitada. Selecionamos 100 estirpes tendo em consideração os factores epidemiológicos do hospedeiro com influência na transmissibilidade da estirpe. Após sequenciação do genoma, estas estirpes foram submetidas a uma análise de convergência evolutiva. Identificamos seis genes/regiões intergénicas - Espe, PE PGRS33, PE PGRS56, Rv0197, e Rv2815-16c Rv2813-14c - como estando associados com a transmissão de Mtb, e validamos estes resultados através da análise da resposta de leucócitos a extractos de bactérias com ou sem as mutações nos seis genes/regiões intergénicas mencionados. Demostramos que existem diferenças na resposta imunitária – em termos da produção in vitro de citoquinas pelos monócitos e células T, espécies reativas de oxigénio e apoptose de neutrófilos - associadas às alterações genéticas estudadas. As conclusões desta tese não só contribuem para a melhor compreensão da interação de fatores bacterianos no estabelecimento de linhagens com uma maior transmissibilidade, como têm implicações para o futuro da vigilância e contenção da transmissão, providenciando, por exemplo, as ferramentas necessárias para a identificação de doentes portadores de estirpes particularmente transmissíveis.