Protein signatures in uterine aspirates to improve diagnosis of endometrial cancer 'The CEMARK project'

Alrededor del 30% de las pacientes con cáncer de endometrio (CE) son diagnosticadas en un estadio avanzado de la enfermedad, asociado con un drástico descenso de la supervivencia a los 5 años. El diagnóstico se realiza mediante el examen histopatológico de una biopsia endometrial, que se obtiene preferiblemente mediante una aspiración mínimamente invasiva del interior de la cavidad uterina (aspirado uterino). Desafortunadamente, el número limitado de células en estas biopsias está asociado a dos inconvenientes importantes: i) alrededor del 22% de pacientes no reciben un diagnóstico definitivo con esta muestra; y ii) el tipo histológico y grado de los casos de CE son asignados incorrectamente hasta en el 50% de los casos. El objetivo principal de esta tesis es la identificación de paneles proteicos específicos y sensibles que permitan: i) discriminar todos los casos CE y no-CE empleando muestras de aspirado uterino y así reducir el número de biopsias más invasivas; y ii) proporcionar una información preoperatoria del tipo histológico y el grado tumoral de los casos de CE más precisa para mejorar la clasificación de las pacientes en grupos de riesgo. En el Capítulo 1 se realizó una extensa revisión bibliográfica y se generó una lista de 506 proteínas asociadas con CE. El análisis de las características de los estudios incluidos en esta revisión nos permitió definir nuevas aproximaciones que podrían acelerar la identificación de proteínas clínicamente útiles para el diagnóstico del CE. Estas aproximaciones se aplicaron en los pasos descritos en los siguientes capítulos. Así, en el Capítulo 2 se demostró que esas proteínas previamente asociadas con CE, principalmente estudiadas por inmunohistoquímica a nivel de tejido, se pueden medir en muestras de aspirado uterino mediante técnicas de proteómica dirigida. Además, se seleccionó la fracción líquida de estas muestras como la fracción más apropiada para la identificación de biomarcadores. En el Capítulo 3 se describió un flujo de experimentales para reducir la lista inicial de 506 proteínas a los 52 candidatos con mayor potencial, que fueron analizados en la fracción líquida de aspirados uterinos de 20 pacientes con CE y 18 controles por LC-PRM. Se observó la expresión diferencial de 26 proteínas, y entre ellos diez biomarcadores mostraron una alta sensibilidad y especificidad (AUC> 0.9). Demostramos la importancia de los estudios de verificación por espectrometría de masas dirigida, y destacamos los beneficios del LC-PRM para este propósito. En el Capítulo 4 las mismas 52 proteínas fueron validadas en aspirados uterinos de 116 pacientes por LC-PRM. Los niveles de 28 proteínas eran significativamente mayores en las pacientes de CE (n=69) en comparación con los controles (n=47). La combinación de MMP9 y KPYM alcanzaba un 94% de sensibilidad y un 87% de especificidad para detectar casos de CE. Este panel complementa perfectamente el diagnóstico histopatológico estándar, logrando el 100% de diagnósticos correctos en este estudio. Los niveles de nueve proteínas se encontraron significativamente aumentados en los CE de tipo endometrioide (n=49) comparados con los CE de tipo seroso, más agresivos (n=20). La combinación de CTNB1, XPO2 y CAPG alcanzaba una sensibilidad del 95% y una especificidad del 96% en la discriminación de estos subtipos. Con el fin de facilitar la implementación de estos paneles de biomarcadores en la práctica clínica, se evaluó la transferencia de los resultados de LC-PRM a kits de ELISA disponibles comercialmente. Además, en el Capítulo 5 se evaluó la simplificación del ensayo analítico y de la preparación de la muestra. Se espera que estos paneles proteómicos en aspirado uterino mejoren el diagnóstico de CE, reduciendo el número de biopsias invasivas, ayudando en la predicción del tratamiento quirúrgico óptimo, y reduciendo los costes sanitarios asociados a esta enfermedad.
About 30% of endometrial cancer (EC) patients are still diagnosed at an advanced stage of the disease associated with a drastic decrease in the 5-year survival rate. Diagnosis is achieved by the histopathological examination of an endometrial biopsy, which is preferably obtained by a minimally invasive aspiration from the uterine cavity (i.e., uterine aspirate). Unfortunately, the limited number of cells available for examination in these biopsies is associated with two important drawbacks: i) around 22% of undiagnosed patients due to histologically inadequate specimens; and ii) up to 50% of incorrectly assigned EC histotype and grade. The main goal of this thesis is the identification of specific and sensitive proteomic signatures able to: i) accurately discriminate between EC cases and non-EC women with suspicion of EC in uterine aspirate samples, and thus to reduce the number of more invasive sampling methods; and ii) provide clinicians more accurate preoperative information regarding EC histological type and tumor grade that could improve the risk stratification of the patients. In Chapter 1 an extensive literature review was performed, and a list of 506 proteins associated with EC was generated. The analysis of the main characteristics of the studies included in this literature review allowed us to outline approaches not yet exploited that might accelerate the identification of clinically useful proteins for EC diagnosis. These approaches were applied in the workflow described in the next chapters. In Chapter 2 we demonstrated that those proteins previously associated with EC, mainly studied by immunohistochemistry at the tissue level, can be measured in uterine aspirate samples by highly multiplexing targeted proteomics. Moreover, we selected the fluid fraction of these uterine aspirates as the most appropriate fraction for biomarker identification. In Chapter 3 we described a stepwise workflow to reduce the initial list of 506 candidate biomarkers generated in Chapter 1 down to 52 proteins that were analyzed in the fluid fraction of uterine aspirates from 20 EC patients and 18 non-EC controls by LC-PRM. The differential expression of 26 proteins was observed, and among them ten biomarkers showed a high sensitivity and specificity (AUC > 0.9). We demonstrated the importance of targeted mass spectrometry-based approaches in biomarker verification studies to prioritize the most promising biomarkers to enter a validation study, and highlighted the benefits of LC-PRM acquisition performed on high-resolution accurate mass spectrometers for this purpose. The same 52 proteins were then validated in the uterine aspirates from 116 patients by LC-PRM, as described in Chapter 4. The levels of 28 proteins were significantly higher in EC patients (n=69) compared to controls (n=47). The combination of MMP9 and KPYM exhibited 94% sensitivity and 87% specificity for detecting EC cases. This panel perfectly complemented the standard histopathological diagnosis, achieving 100% of correct diagnosis in this dataset. Nine proteins were significantly increased in endometrioid EC (n=49) compared to less common but more aggressive serous EC (n=20). The combination of CTNB1, XPO2 and CAPG achieved 95% sensitivity and 96% specificity for the discrimination of these subtypes. In order to facilitate the implementation of these biomarker signatures in the clinical practice, the translation of the LC-PRM results to commercially available ELISA kits was then evaluated. Moreover, simplification of the analytical assay and the sample preparation was assessed in Chapter 5. The two uterine aspirate-based proteomic signatures developed in this thesis are expected to improve EC diagnosis, precluding the use of subsequent invasive sampling methods; and to assist in the prediction of the optimal surgical treatment. In the long term, the implementation of these signatures is expected to improve the management of EC patients and substantially reduce healthcare costs.