Development and validation of a new nephrotoxicity model mimicking cell physiology microenvironment

Los riñones son órganos muy eficientes que llevan a cabo múltiples funciones en el organismo. Una de las principales funciones que realizan es la eliminación de productos de desecho y exceso de fluido del cuerpo a través de la orina. La regulación de las sales y el contenido de ácido, son funciones desempeñados por estos órganos. En el riñón también tiene lugar la producción de diferentes hormonas. El riñón está constituido por las nefronas, que son las unidades estructurales y funcionales de estos órganos. Dentro de las nefronas podemos diferenciar las siguientes estructuras: El glomérulo, que es la primera parte de la nefrona donde el plasma es filtrado desde la sangre. Inmediatamente después, encontramos el túbulo, cuya estructura es semejante a un tubo largo y estrecho, donde el fluido filtrado desde la sangre es procesado y convertido en orina. A lo largo del túbulo, encontramos los siguientes segmentos: túbulo proximal, asa de Henle, túbulo distal y tubo colector.En esta Tesis Doctoral, nos centraremos en el estudio del segmento formado por el túbulo proximal (TP) [1]. La principal función desempeñada por el TP es la reabsorción y secreción de metabolitos y para realizar estas funciones las células del TP cuentan con un gran contenido de diferentes transportadores de membrana [2-5]. El túbulo proximal está formado por células epiteliales, las cuales están polarizadas, característica que nos permite distinguir entre dos zonas bien diferenciadas, la zona apical y la zona basolateral. Las células del TP contienen una estructura denominada borde en cepillo que aumenta el área de superficie de las células y este incremento es útil durante los procesos de reabsorción [6]. Conviene destacar que las células renales están continuamente expuestas al ultra filtrado del plasma y que el flujo luminal genera una fuerza de cizallamiento (shear stress, SS) sobre la superficie apical de las células. Las células del TP pueden detectar estas SS a través del cilio primario o de las microvellosidades del borde en cepillo. La señalización intracelular desencadenada por la SS luminal es un estímulo fisiológico clave para las células tubulares renales [7]. A pesar de la relevancia del flujo luminal en la nefrona, así como en el desarrollo de enfermedades, hay relativamente pocos estudios in vitro que incluyan este estímulo. El flujo luminal debería ser un requisito imprescindible para la generación de un modelo de función tubular in vitro, fisiológicamente más similar al que encontramos in vivo.Las células del TP in vivo presentan unas características dinámicas diferentes en ambos compartimentos. Cuando se trabaja in vitro, se alteran esas características dinámicas ya que las células son expuestas a la inmovilización de su compartimento basolateral, en contacto con la superficie donde las células crecen y en el lado apical se renueva el medio cada 2-4 días, eliminando el efecto que el SS ejerce en ambos compartimentos. La ausencia del flujo luminal, así como la alteración de las características dinámicas de las células en ambos compartimentos, son dos de los problemas que encontramos en las condiciones de cultivo convencional 2D, eliminando la posibilidad de reproducir la función tubular renal, la cual consiste en concentrar o diluir los solutos en el fluido luminal. Por tanto, es evidente que las técnicas de cultivo convencionales 2D, a pesar del gran conocimiento que nos han aportado sobre la función celular y molecular, no son capaces de reproducir el ambiente fisiológico de las células del TP. Esto a la vez, podría explicar la dificultad en la traslación de los resultados in vitro a aplicaciones in vivo [8].En los últimos años y con el objetivo de aproximarse a la creación in vitro de microambientes fisiológicamente más similares a los encontrados in vivo, han surgido colaboraciones entre las áreas de Ingeniería y las áreas de Biología [9] interesadas en el desarrollo de dispositivos microfluídicos [10] para su uso en estudios de epitelio renal. Los dispositivos mencionados anteriormente, son estructuras situadas en la escala micro y nano, que han posibilitado el desarrollo de los microchips, dispositivos miniaturizados capaces de imitar sistemas naturales de forma precisa si se acoplan a sistemas continuos de perfusión en los canales que componen estos dispositivos, los cuales son habitados por las células sembradas en ellos. Estos dispositivos ofrecen ventajas como la reproducción de la arquitectura multicelular o de la interfaz tejido-tejido, la recreación del microambiente físico-químico y la perfusión vascular, originando niveles de tejidos funcionales, que no pueden obtenerse con los métodos de cultivo 2D o 3D. Otra ventaja, es que al trabajar en escala micro-nanométrica, el ahorro de las soluciones necesarias paras el mantenimiento de las células, o para la ejecución de experimentos, se ve drásticamente reducido. A nivel experimental, este tipo de dispositivos presentan gran potencial en el área de la organogénesis y la fisiología y, en el contexto del descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos, tiene especial valor en el estudio de los mecanismos de acción, toxicidad e identificación de biomarcadores.A partir de la información expuesta anteriormente, se detectó un problema y se propuso una hipótesis: las herramientas de cultivo convencionales no recrean con precisión el ambiente fisiológico donde crecen las células y por tanto, esto puede originar la pérdida de reproducibilidad de la respuesta celular contra agentes tóxicos y mecanismos de reparación unidos a daño renal. Con el objetivo de aceptar o rechazar la hipótesis propuesta se propone la creación de un modelo de nefrotoxicidad, usando dispositivos de cultivo biomiméticos que tendrán acoplados las herramientas necesarias para poder usar flujo, y de esta manera reproducirán mejor el microambiente de las células del TP.La elección del TP para desarrollar esta Tesis, se basa en que en este segmento de la nefrona se procesa la mayoría de tóxicos y fármacos y tiene lugar el daño agudo y crónico renal. Por tanto, desde el punto de vista clínico y con el objetivo de estudiar nefrotoxicidad, el TP representa un segmento cuyos estudios pueden aportar mucho conocimiento. Con el objetivo de crear un modelo de nefrotoxicidad, el uso de cultivos primarios de células del TP humanas (hPTPC), daría lugar a una fácil traslación de los resultados a la clínica.La molécula elegida para la creación del modelo de nefrotoxicidad es el cisplatino, un compuesto antitumoral usado en el tratamiento contra diversos tipos de cánceres, entre los que destacan pulmón, testículo y cérvix. Uno de los principales efectos secundarios de este compuesto es la nefrotoxicidad [11] en el TP. Los mecanismos de acción del cisplatino incluyen su paso al interior de las células del TP mediante los transportadores basolaterales OCT2 y CTR-1, así como la enzima GGT1, encargada de la conversión del cisplatino en una molécula mucho más reactiva tras entrar en contacto con esta enzima [12]. A partir de las hPTPC y del modelo de nefrotoxicidad que se desarrolló, se estudió el efecto de la estimulación mecánica proporcionado por el flujo, sobre la sensibilidad al cisplatino, permitiendo recrear un ambiente más semejante al que encontramos in vivo. Los resultados obtenidos a lo largo de esta tesis nos sugieren que:1. El protocolo de aislamiento empleado para la obtención de células primarias de TP procedentes de nefrectomías humanas, hPTPC, y la posterior caracterización de las células, nos permitió obtener un cultivo formado mayoritariamente por células de TP que expresaban los principales marcadores de este segmento de la nefrona.2. El uso combinado del ensayo de actividad enzimática de GGT1 y el ensayo de viabilidad, nos permitió distinguir los efectos del cisplatino. La combinación de estos ensayos se validó como una herramienta útil a la hora de monitorizar la función celular y viabilidad celular.3. El modelo de nefrotoxicidad empleando cisplatino fue consistente para su uso en células creciendo en dispositivos fluídicos.4. El cultivo de hPTPC aislado y caracterizado durante esta tesis, no mostró diferencia en la sensibilidad al modelo de cisplatino en dispositivos fluídicos en presencia de la estimulación mecánica proporcionada por el flujo y comparado con células en condiciones estáticas. The kidneys are very efficient organs that perform multiple functions in the body. One of the main functions performed by the kidneys is the elimination of waste products and excess fluid from the body through the urine. The regulation of body salts and acid content are functions played by these organs. In the kidney also takes place the production of different hormones. The kidney is made up of nephrons, which are the structural and functional units of these organs. The nephrons are composed by the following structures: The glomerulus, which is the first part of the nephron, where the plasma is filtered from the blood. Immediately afterward, we find the tubule, which structure is like a long narrow tube, where the filtered fluid from the blood is processed into the urine. The tubule is divided into different segments: proximal tubule, loop of Henle, distal tubule and collecting tube. In this Thesis, we focused on the study of the segment formed by the proximal tubule (PT). The main role played by the PT is the reabsorption and secretion of metabolites and to perform these functions, PT cells have a high content of different membrane transporters. The PT is formed by epithelial cells, which are polarized, a feature that allows us to distinguish between two distinct areas, the apical zone, and the basolateral zone. PT cells contain a structure called brush border that increases the surface area of the cells, and this increase is useful during the reabsorption processes. It should be noted that renal cells are continually exposed to ultrafiltration of the plasma and that the luminal flux generates a shear stress (SS) on the apical surface of the cells. PT cells can detect this SS through the primary cilium or the brush border. The intracellular signaling triggered by the luminal SS is a physiological stimulus essential for renal tubular cells. Despite the relevance of luminal flow in the nephron, as well as in the development of diseases, there are relatively few in vitro studies including this stimulus. Luminal flow should be a prerequisite for the generation of an in vitro physiological model to study tubular function, similar to what is found in in vivo environment. PT cells in vivo exhibit different dynamic characteristics in both compartments. When we are working with these cells in vitro, these dynamic characteristics are altered since the cells are exposed to the immobilization of their basolateral compartment, in contact with the surface where the cells grow, and on the apical side, the medium is renewed every 2-4 days, eliminating the effect that the SS exerts on both compartments. The absence of luminal flow, as well as the alteration of the dynamic characteristics of the cells in both compartments, are two of the problems found in conventional 2D culture conditions, eliminating the possibility of reproducing renal tubular function, which consists of concentrating or diluting the solutes present in the luminal fluid. Therefore, it is evident that conventional 2D culture techniques, despite the high knowledge that they have provided us on the cellular and molecular function, are not able to reproduce the physiological environment of the PT cells. This could explain the difficulty we have in translating in vitro results into in vivo applications. In the last years, with the aim of creating in vitro microenvironments physiologically similar to those found in vivo, we observe an increase in the number of collaborations between the areas of Engineering and Biology interested in the development of microfluidic devices for use in renal epithelial studies. The devices mentioned above are structures in the micro and nano scale, which have enabled the development of microchips, miniaturized devices capable of accurately mimicking natural systems since they contain continuous infusion systems in the channels that make up these devices, covered by the cells seeded in them. These devices offer advantages such as reproduction of the multicellular architecture or the tissue-tissue interface, the recreation of the physicochemical microenvironment and the vascular perfusion, resulting in levels of functional tissues, which cannot be obtained with 2D or 3D culture methods. Another advantage is the size of these devices, in the micro-nanometric scale. This supposes to save solutions for the maintenance of the cells, or for the execution of experiments because their volume is drastically reduced. At the experimental level, this type of device has great potential in the area of organogenesis and physiology and, in the context of discovery and development of new drugs, it has a special value in the study of the mechanisms of action, toxicity, and identification of biomarkers. From the above information, a problem was detected and a hypothesis was proposed: the conventional culture tools do not accurately recreate the physiological environment where the cells grow and therefore, this can cause the lack of reproducibility of cellular response to toxic agents and repair mechanisms linked to renal damage. With the objective of accepting or rejecting the proposed hypothesis, it was proposed to create a model of nephrotoxicity using biomimetic culture devices that will have the necessary tools coupled to be able to use flow. This will help to reproduce the microenvironment of PT cells more accurately. The choice of PT to develop this Thesis is based on the fact that in this segment of the nephron the majority of toxins and drugs are processed and here is where acute and chronic renal damage take places. Therefore, from the clinical point of view and with the aim of studying nephrotoxicity, PT represents the segment of choice. In order to create a model of nephrotoxicity, the use of human primary cultures of PT cells (hPTPC), would lead to an easy translation of the results to the clinic. The molecule chosen to create the nephrotoxicity model is cisplatin, an antitumor compound used in the treatment of various types of cancers, including lung, testis and cervix. However, one of the major side effects of this compound is nephrotoxicity in PT. The mechanism of action of cisplatin includes the entrance of the molecule to the hPTPC through the basolateral transporters OCT2 and CTR-1, as well as the enzyme GGT1, responsible for the conversion of cisplatin into a much more reactive molecule after entering in contact with this enzyme. From the hPTPC and the nephrotoxicity model developed, we proposed to study the effect of mechanical stimulation on cisplatin sensitivity produced under flow. This allowed us to recreate a more physiological environment, closer to what we find in vivo. The results obtained along this Doctoral Thesis suggest: 1. The isolation protocol employed to obtain primary PT cells from human nephrectomies, hPTPC, and the posterior cell characterization, allowed us to obtain a highly enriched culture of PT cells, expressing the main PT markers. 2. Combined use of GGT1 activity and cell viability assays allowed us to distinguish different cisplatin effects and were validated as useful assays to monitor cell function and cellular status. 3. The cisplatin nephrotoxicity model was consistent and amenable for its use on cells grown in microfluidic devices. 4. The hPTPC isolated and characterized along this Thesis did not present any difference in the sensitivity to cisplatin model in fluidic devices in the presence of the mechanical stimulation created by flow and compared with cells growing in static condition.