Charackterisierung von PfFNT – ein Laktat Transporter in Plasmodium falciparum

A distinctive character of the mature intraerythrocytic form of the malaria parasite, Plasmodium falciparum, is a high glycolytic flow rate to fulfill its energetic requirements. This action produces two mole of lactic acid per mole of glucose as the anaerobic end product resulting in large quantities that need to be removed from the parasite cytosol. On its way out into the bloodstream lactate has to cross three different phospholipid bilayers, the parasite plasma membrane, the parasitophorous vacuole membrane and the red blood cell membrane. Although transport characteristics have been described for lactate in P. falciparum the molecular identity of the underlying permease(s) is still unknown. Here the discovery of a gene, PfFNT, responsible for the peptide that facilitates lactate transport over the parasite plasma membrane is described. It is a member of the formate nitrite transporter family (FNT) with high sequence similarities to microbial FNTs. For characterization of the protein a Saccharomyces cerevisiae knock out strain was employed that has lost the ability to transport monocarboxylates. Using this system PfFNT lactate/proton symport was found. This was confirmed by a direct proportionality of L-lactate transport to the prevailing pH gradient. Moreover when this gradient was abolished by proton decouplers, i.e. carbonylcyanide-3-chlorophenylhydrazone (CCCP) and 2,4-dinitrophenol (DNP), transport ceased. The PfFNT facilitated substrate pattern fits microbial FNTs, with acetate exhibiting the highest permeability followed by formate, L-lactate, D-lactate and pyruvate in decreasing order. The dicarboxylate malonate was excluded showing selectivity of monovalent anions over multivalent anions which is also a common feature shared by all FNTs discovered so far. The non-charged molecule glycerol, which is similar in size to lactate, was also excluded. Moreover facilitation features, such as transport rates and inhibition profile, match earlier findings from measurements performed in isolated living parasites in vitro hinting at a central position of PfFNT in parasite metabolism. For this the antiplasmodial compounds phloretin, furosemide, and cinnamate derivatives where tested revealing IC50 values around 1 mM. Inhibition requires a negative moiety though, since the uncharged cinnamamide had no effect. Notably the organomercurial p-chloromercuribenzene sulfonate (pCMBS), an inhibitor of human lactate transport, did not alter transport rates of PfFNT. This, taken together with the fact that there are no FNT homologs apparent in the human genome indicates PfFNT as a novel promising antimalarial drug target. Additionally PfFNT is the only transporter of the plasmodial glycolytic pathway for which structure information is available from crystals of homologous proteins predisposing it to further design of high affinity inhibitors. Ein herausragendes Merkmal des intraerythrozytären Malariaerregers, Plasmodium falciparum, ist eine hohe glykolytische Flussrate um seinen Energiebedarf zu decken. Bei diesem Vorgang werden aus einem Molekül Glukose zwei Moleküle Laktat gebildet, welches als metabolisches Endprodukt in hohen Mengen anfällt und aus dem parasitären Zytosol ausgeschleust werden muss. Auf seinem Weg ins Blut muss das Laktat drei Phospholipid Doppelmembranen überwinden, die parasitäre Plasmamembran, die parasitäre Vakuolen Membran und die Membran der Erythrozyten. Obwohl diese Transportprozesse in P. falciparum bereits beschrieben wurden, konnte die molekulare Identität der zugrunde liegenden Permease(n) bis jetzt nicht geklärt werden. In dieser Arbeit wurde das Gen, PfFNT, identifiziert das für das Peptid codiert, welches für die Laktatleitung über die Parasiten Membran verantwortlich ist. Es gehört zur Familie der Formiat Nitrit Transporter (FNT) und besitzt ähnliche Transporteigenschaften wie mikrobielle FNTs. Zur Charakterisierung des Proteins wurde ein Saccharomyces cerevisiae knock-out Stamm verwendet, welcher nicht dazu befähigt ist Monocarboxylate zu transportieren. In diesem System wurde gezeigt, dass PfFNT Laktat in Symport mit Protonen leitet. Dieses wurde durch eine direkt zum vorherrschenden pH-Wert proportionale Transportrate belegt. Zudem konnte der Transport gestoppt werden, indem der pH-Gradient durch Protonenentkoppler, wie Carbonylcyanid-3-chlorophenylhydrazon (CCCP) und 2,4-Dinitrophenol (DNP) zerstört wurde. Das durch PfFNT geleitete Subtratspektrum entspricht dem der bisher beschriebenen mikrobiellen FNTs. Dabei zeigt das Acetat Molekül die höchste Permeabilität, gefolgt von Formiat, L-Laktat, D-Laktat und Pyruvat in absteigender Reihenfolge. Das zweifach negativ geladene Malonat wurde nicht transportiert, was ebenfalls zu der Selektivität der bisher beschriebenen FNTs passt, die alle nur einfach geladene Anionen leiten. Das ungeladene Glycerol, welches eine ähnliche Größe zum Laktat Molekül aufweist, wurde ebenfalls nicht transportiert. Des Weiteren passen die Transporteigenschaften, wie Transportrate und Inhibitionsprofil zu denen, welche aus Daten gewonnen wurden, die in lebenden isolierten Parasiten in vitro gemessen wurden. Dieses deutet auf eine zentrale Rolle von PfFNT im parasitären Metabolismus hin. Hierfür wurden die antiplasmodial wirkenden Substanzen Phloretin, Furosemid und Zimtsäurederivate getestet, welche alle IC50 Werte um 1 mM zeigen. Inhibition erfordert zudem eine einzelne negative Ladung da das ungeladene Zimtsäureamid keine Wirkung auf die Transportrate hat. Bemerkenswert ist, dass die Organoquecksilber-Verbindung p-Chloromercuribenzensulfonat (pCMBS), ein bekannter Inhibitor des menschlichen Laktat Transports, den Transport durch PfFNT nicht verändert. Dies, zusammengenommen mit der Tatsache, dass es keine homologen Gene zu FNTs im menschlichen Genom gibt, deutet auf eine potentielle Rolle von PfFNT als neues Wirkstoffziel zur Behandlung von Malaria hin. Zusätzlich ist PfFNT der einzige Transporter des plasmodialen glykolytischen Stoffwechsels für den Strukturdaten aus Proteinkristallisationen in hoher Auflösung verfügbar sind. Daher ist PfFNT prädispositioniert für ein Design von hochaffinen Inhibitoren.