Nükleotid saflaştırılması için baskılanmış manyetik poli(hidroksietil metakrilat) (mphema) nanoküreler

Nucleotides and nucleosides participate in other metabolic functions because they are part of the biosynthetic pathways and play an important role as biological regulators. Nucleotides in various forms play an important role in cell growth and energy metabolism, genetic transmission and signal transduction. The nucleotides serve as either nucleoside 5p-phosphates or as metabolic signaling molecules in the form of modified nucleotides such as 3p, 5'-cyclic adenosine monophosphate (AMP), guanosine tetraphosphate (ppGpp) and 3p, 5'-cyclic diGMP. There are different studies in the literature on the preparation of synthetic receptors for each of the nucleotides. However, the process of designing artificial receptors is often complex and difficult. As an alternative to these methods, the molecular suppression technique allows the preparation of fast, simple and selective polymeric receptors. MIPs are synthetic polymeric materials with specific molecular recognition capabilities that provide high selectivity to selected target molecules. In this thesis, a review of the role of nanotechnology in nucleotide purification is presented. Magnetic 2-hydroxyethyl methacrylate (mPHEMA) nanospheres were synthesized by miniemulsion polymerization method in the presence of Fe3O4 (magnetite) for cytidine purification using molecular suppression method. N-methacryloyl-(L)-histidine methyl ester (MAH) was selected as the functional monomer in the preparation of Cyt-imprinted nanospheres (MIP). MAH and Cu(II) prepared by providing coordination between the complex formation MAH-Cu(II) complex to pre-complex by adding Cyt target molecule is prepared. The unpressured (NIP) mPHEMA without the target molecule was prepared by the same method. Characterization studies of prepared nanospheres were performed by using; Nono Zeta Sizer for size analysis, Brunauer Emmet Teller (BET) method for surafce area measurement, Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) for structural analysis of polymers, scanning electron microscopy (SEM) dor surface morphology and electron spin resonance (ESR) spectroscopy for determination of magnetic properties of polymeric structures. After characterization studies, initial concentration, pH, temperature, time dependent change and ionic strength parameters of Cyt nucleotide suppressed nanospheres were investigated to determine the maximum adsorption conditions in aqueous solutions. Selectivity experiments with uridine (Uri) and thymidine (Tym) competitor nucleotides were performed to determine the selectivity of Cyt-imprinted nanospheres. In order to determine the reusability of Cyt-imprinted nanospheres, the adsorption-desorption process was repeated 10 times using the same nanospheres. As a result, in this study, Cyt imprinted magnetic nanospheres synthesized by combining metal coordination and molecular imprinting technique have been successfully synthesized as a highly effective material for high selectivity recognition of Cyt. ÖZET i ABSTRACT iii ÇİZELGELER ix 1.GİRİŞ………………………………………………………………………………...1 2. GENEL BİLGİLER 4 2.1. Moleküler Baskılama Teknolojisi 4 2.2. Moleküler Baskılama Yöntemleri 6 2.2.1. Kovalent Baskılama Yöntemi 6 2.2.2. Kovalent Olmayan Baskılama Yöntemi 7 2.2.3. Yarı-Kovalent Baskılama Yöntemi 9 2.3. Metal Şelat Etkileşimleri 10 2.4. Baskılamayı Etkileyen Faktörler 11 2.4.1. Kalıp Moleküller 11 2.4.2. Fonksiyonel Monomer 12 2.4.3. Çapraz Bağlayıcı 13 2.4.4. Porojen Çözücüler 14 2.5. Polimerizasyon Sentez Teknikleri 15 2.5.1. Emülsiyon Polimerizasyonu 15 2.6. Nanoküreler ve Manyetik Nanoküreler 20 2.6.1. Manyetik Nanokürelerin Sentezi 23 2.7. Nükleotidler ve Sitidin 26 2.7.1. Nükleik Asitlerin Bileşenleri 29 2.7.2. Nükleotidlerin Biyosentezi 30 2.8. Sitidin Nükleotidlerin Sentezi 33 4. DENEYSEL YÖNTEMLER 36 3.1. Kimyasal Malzemeler 36 3.2. PHEMA Manyetik Nanokürelerin Sentezi 36 3.3. N-metakriloil-(L)-Histidin Metil Ester (MAH) Monomerinin Sentezi 38 3.4. MAH-Cu(II) Kompleksinin Hazırlanması 38 3.5. Sitidin Baskılanmış (Cyt-MIP) manyetik nanokürelerin hazırlanması 39 3.6. Kalıp Molekülün (Sitidin) Uzaklaştırılması 39 3.7. Nanokürelerin Karakterizasyon Çalışmaları 39 3.7.1. Zeta Size ile Boyut Analizi 39 3.7.2. Yüzey Alanı Analizi 40 3.7.3. Taramalı Elektron Mikroskopu (SEM) Analizi 40 3.7.4. FTIR Çalışmaları 40 3.7.5. Elektron Spin Rezonans (ESR) Spektrometresi İle Manyetik Analiz 41 3.8. Adsorpsiyon Çalışmaları 41 3.9. Seçicilik Deneyleri 42 3.10. Desorpsiyon ve Tekrar Kullanılabilirlik 42 5. SONUÇLAR 44 4.1. Nanokürelerin Karakterizasyonu 44 4.1.1. Zeta Boyut Analizi 44 4.1.2. Yüzey Alanı Analizi 47 4.1.3. Fourier Transform Infrared Spektroskopisi (FTIR) Analizi 47 4.1.4. Taramalı Elektron Mikroskopi Analizi (Screening Electron Microscopy, SEM) 49 4.1.5. Manyetik Analiz 52 4.2. Adsorpsiyon Çalışmaları 54 4.2.1. Sulu Çözeltilerden Sitidin Adsorpsiyonu 54 4.2.1.1. pH’nın Etkisi 59 4.2.1.2. Sitidin Başlangıç Derişimlerinin Etkisi 60 4.2.1.3. Sıcaklığın Etkisi 61 4.2.1.4. Tuz Tipinin Etkisi 62 4.2.1.5. Adsorpsiyon Zamanı 64 4.2.2. Adsorpsiyon İzotermi 64 4.2.3. Adsorpsiyon Kinetiği 69 4.5. Seçicilik Deneyleri 71 4.6. Desorpsiyon ve Tekrar Kullanılabilirlik 74 6. YORUM 76 6. KAYNAKLAR 80 Nükleozidler ve nükleotidler, biyosentetik yolların bir parçası oldukları ve biyolojik düzenleyiciler olarak önemli bir rol oynadıkları için metabolik fonksiyonlara katılırlar. Nükleotidler çeşitli biçimlerde, hücre büyümesi ve enerji metabolizması, genetik iletim ve sinyal iletimi üzerinde önemli rol oynarlar. Nükleotidler, ya nükleozid 5p-fosfatlar olarak ya da 3p,5'-siklik adenozin monofosfat (AMP), guanosin tetraposfat (ppGpp) ve 3p,5'-siklik diGMP gibi modifiye edilmiş nükleotidler şeklinde metabolik sinyal molekülleri olarak işlev görürler. Nükleotidlerin her biri için sentetik reseptörler hazırlanması konusunda literatürde farklı çalışmalar mevcuttur. Ancak yapay reseptör tasarlama işlemleri genellikle karmaşık ve zordur. Bu yöntemlere alternatif olarak moleküler baskılama tekniği hızlı, basit ve seçici polimerik reseptörler hazırlama olanağı sağlamaktadır. MIP'ler, seçilen hedef moleküllere karşı yüksek seçicilik sağlayan özel moleküler tanıma yeteneklerine sahip sentetik polimerik malzemelerdir. Bu tez kapsamında, nanoteknolojinin nükleotid saflaştırma alanındaki rolünün bir incelemesi sunulmaktadır. Moleküler baskılama yöntemi kullanılarak sitidin saflaştırılması için Fe3O4 (manyetit) varlığında manyetik 2-hidroksietil metakrilat (mPHEMA) nanoküreler miniemülsiyon polimerizasyon yöntemi ile sentezlenmiştir. N-metakriloil-(L)-histidin metil ester (MAH), sitidin baskılanmış nanokürelerin (MIP) hazırlanmasında fonksiyonel monomer olarak seçilmiştir. MAH ve Cu(II) arasında koordinasyon kompleksi oluşumu sağlanarak hazırlanan MAH-Cu(II) kompleksine kalıp molekül Cyt eklenerek ön-kompleks hazırlanmıştır. Kalıp molekül olmaksızın baskılanmamış (NIP) mPHEMA aynı yöntemle hazırlanmıştır. Hazırlanan nanokürelerin karakterizasyon çalışmaları; boyut analizi için Nano Zeta Sizer ve yüzey alanı ölçümleri Brunauer Emmet Teller (BET) yöntemi ile, polimerlerin yapı analizi için Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisiyle (FTIR), yüzey morfolojisi için taramalı elektron mikroskobuyla (SEM) ve polimerik yapıdaki manyetik özelliğin belirlenmesi için elektron spin rezonans (ESR) spektrometresi kullanılarak yapılmıştır. Karakterizasyon çalışmaları sonrasında, Cyt nükleotidi baskılanmış nanokürelerin sulu çözeltilerde maksimum adsorpsiyon koşullarını belirlemek için başlangıç derişimi, pH, sıcaklık, zamana bağlı değişim ve iyonik şiddet parametreleri incelenmiştir. Cyt baskılanmış nanokürelerin seçiciliğinin belirlenmesi için üridin (Üri) ve timidin (Tym) yarışmacı nükleotidleri ile seçicilik deneyleri gerçekleştirilmiştir. Cyt baskılanmış nanokürelerin tekrar kullanılabilirliğinin belirlenmesi amacıyla adsorpsiyon-desorpsiyon işlemi aynı nanoküreler kullanılarak 10 kez tekrar edilmiştir. Sonuç olarak, bu çalışmada metal koordinasyon ve moleküler baskılama tekniğinin birleştirilmesiyle sentezlenen Cyt baskılanmış manyetik nanoküreler Cyt’nin yüksek seçicilikle tanınması için oldukça etkin bir malzeme olarak başarılı bir şekilde sentezlenmiştir.