Optimization of biotransformations in Escherichia coli: from biocatalyst to the process level

Diese Dissertation behandelt Methoden, die f��r eine Optimierung biokatalytischer Transformationen n��tzlich sind. Optimierungen von biokatalytischen Prozessen sollten in verschiedenen Projektphasen durchgef��hrt werden: in der Phase der Katalysatorentwicklung, der Fermentations-/Kultivierungsentwicklung und der Bioprozess- sowie der Produktaufarbeitungsentwicklung. Verbesserungen in allen genannten Phasen tragen zur Produktivit��tssteigerung bei. Beispiele f��r solche Optimierungen sind in dieser Dissertation aufgef��hrt. Im ersten Kapitel wurde die Biotransformation in allen vier im letzten Abschnitt genannten Phasen optimiert. Ein biokatalytischer Prozess zur Synthese von Nylon-9, einem Spezialpolymer, wurde in der Gr��ssenordung von mehreren Dutzend Gramm etabliert. Die Nachfrage nach Spezialpolymeren wie Nylon-9 w��chst; jedoch ist die chemische Synthese der entsprechenden Monomere oft kompliziert. Diese Tatsache erleichtert die Etablierung biokatalytischer Syntheseverfahren. In dieser Arbeit wurde Cyclopendadecanone Monooxygenase (CPDMO) in Escherichia coli als Ganzzellkatalysator verwendet. Das Expressionssystem wurde angepasst, um stabile Expression des Enzyms zu garantieren (Phase der Katalysatorentwicklung). Die Expression wurde in einem definierten und optimierten Medium etabliert (Phase der Kultivierungsentwicklung). Die Implementierung des "Substrat-Feed-Product-Removal" (SFPR) Konzepts mit der entsprechenden Produktaufarbeitung rundete die Optimierung des Prozesses ab (Phase der Bioprozess-/Produktaufarbeitungsentwicklung). In dem Prozess wurde eine vorher beschriebene, gef��hrliche Pers��ure-katalysierte Oxidation durch einen sicheren und skalierbaren biokatalytischen Prozess mit Sauerstoff als Oxidant und Wasser als L��sungsmittel ersetzt. Der verbesserte Prozess setzte 42 g (0.28 mol) Keton zum entsprechenden Lakton um. Die isolierte Ausbeute nach einer sehr effizienten Produktaufarbeitung mit 95 % Wiederfindung der umgesetzten Stoffmenge betrug dabei 70 % (33 g), was einer volumetrischen Ausbeute von 8 g pures Lakton pro Liter Kulturvolumen entsprach. Im Folgenden wurde die M��glichkeit der Optimierung eines Ganzzellkatalysators untersucht (Phase der Katalysatorentwicklung). Ein kinetisches Modell f��r die Simulation und Optimierung einer enzymatischen in vivo Redox-Kaskade in Escherichia coli (E. coli) wurde erstellt, bestehend aus der Kombination einer Alkoholdehydrogenase (ADH), einer Enoatreduktase (ERED) und einer Baeyer-Villiger Monooxygenase (BVMO, speziell Cyclohexanone Monooxygenase (CHMO)). Die Kaskade diente zur Sythese von Laktonen. Das Modell wurde verwendet, um die aktiven intrazellul��ren Enzymkonzentrationen in den sequenziellen Biotransformationen zu bestimmen und um daraufhin den Engpass in der Laktonproduktion zu identifizieren sowie Optimierungsstrategien zu erstellen. Die in in vitro Experimenten mit isolierten Enzymen ermittelten Michaelis-Menten Parameter wurden verwendet, um die Verl��ufe der Intermediat- und Produktkonzentrationen in den in vivo Kaskadenreaktionen zu simulieren. Das Modell zeigte, dass das schnellste Enzym, die CHMO, der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Kaskade war. Der Grund daf��r war die geringe Konzentration der aktiven Form des Enzyms, die die Bildung von reversiblen Nebenreaktionen erm��glichte. Es wurde ein wesentlicher experimenteller Beweis erbracht, dass die geringen Konzentration an Flavin- und Nicotinamidkofaktoren der Grund f��r die drastisch verminderte Leistung der in vivo Kaskade verantworlich waren. Als N��chstes wurde das Verhalten von CHMO im Ganzzellsystem untersucht, um Gr��nde f��r die geringe Leistung in vivo zu finden sowie um Optimierungsstrategien zu erarbeiten (Phase der Katalysatorentwicklung). Die Messungen der in vivo Aktivit��t und Stabilit��t der CHMO erfolgten im E. coli Ganzzellsystem. Die CHMO wurde oft als in vitro instabil beschrieben. Vor Kurzem wurde postuliert, dass sich das Enzym in Abwesenheit von notwendigen Kofaktoren und Antioxidantien sehr schnell deaktiviert. Zudem wurde das Enzym im letzten Kapitel als der geschwindigkeitsbestimmende Schritt einer im Ganzzellsystem exprimierten enzymatischen Kaskade identifiziert. Jedoch wurde die in vivo Stabilit��t dieses Enzyms soweit kaum erforscht. Die Aktivit��t und Stabilit��t der CHMO wurde unter g��ngigen E. coli Expressionsbedingungen gemessen sowie die F��higkeit des Wirtsorganismus diese Eigenschaften der CHMO aufrechtzuerhalten mittels Metabolomics analysiert. Es zeigte sich, dass E. coli nicht in der Lage war, die notwendigen Kofaktorkonzentrationen bereitzustellen, die notwendig sind, um CHMO zu stabilisieren. Dennoch wurde die CHMO in ausreichenden Konzentrationen im E. coli produziert und die Konzentrationen waren nach der Produktion f��r den Zeitraum der Messungen bis zum Experimentende unver��ndert. Biotechnologische Anwendungen in diesem Wirtsorganismus mussten somit bisher mit der Restaktivit��t der CHMO von 5 % auskommen. Deswegen k��nnten andere Mikroorganismen effizientere Produktionsplattformen f��r die Produktion der CHMO und verwandter Enzyme bieten. Als letzter Optimierungsschritt in der Phasen der Katalysator- und Kultivierungsentwicklung wurde die in vivo Charakterisierung der Dihydroxyacetonkinase (DhaK), produziert in E. coli, pr��sentiert. Der Schwerpunkt lag dabei auf den physiologischen und metabolomischen Ver��nderungen im Expressionssystem im Vergleich mit dem E. coli Wildstamm. Die DhaK kann zur Synthese von Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) aus Dihydroxyaceton (DHA) unter ATP Verbrauch eingesetzt werden und k��nnte somit zur Erleichterung von Aldolreaktionen in vivo dienen, da DHAP f��r viele Aldolasen ein Donormolek��l darstellt. Trotz der metabolischen Last der Enzymsynthese und Plasmiderhaltung, zeigte der DhaK Stamm ��hnliche physiologische Charakteristika wie der Wildtyp. Im Gegensatz zum Wildtyp, zeigte die DhaK Mutante Aufnahme von DHA sowie erh��hte intrazellul��re DHAP Konzentrationen w��hrend des exponentiellen Wachstums. Die Metabolomanalyse zeigte, dass der ATP Pool, der f��r die enzymatische Phosphorylierung von DHA ben��tigt wird, w��hrend der nicht-wachsenden Bedingungen zu gering war und diese somit nur unter wachsenden Bedingungen stattfinden konnte. Die Modellierung beider St��mme zeigte die M��glichkeit eines Bypasses der oberen Glykolyse durch die Expression der DhaK und die Zugabe von DHA. Diese Ans��tze bed��rfen weiterer Untersuchungen, vor Allem mit 13CMetabolischer Flussanalyse. Abschliessend wurde das vorgestellte System mit einer Aldolproduzierenden enzymatischen Kaskade in E. coli modelliert und in silico als f��rderlich f��r DHAP-abh��ngige Aldolreaktionen befunden. Die Optimierungen der verschiedenen Phasen einer biokatalytischen Transformation wurden in dieser Arbeit kombiniert angewendet und verschiedene Methoden wurden unterst��tzend herangezogen - Modellierung, Metabolomanalyse und Optimierungen im Reaktionsdesign. Diese wurden erfolgreich angewendet, um Biotransformationen in lebenden Ganzzellsystemen zu erm��glichen.
This thesis deals with tools for optimization of biocatalytical transformations. The optimization of biocatalysis should be performed on different levels: on the catalyst level, on the fermentation/cultivation level, and on the process level as well as the downstream processing (DSP) level. All levels contribute to the enhancement of productivity and examples for their optimization are given in the following theses. In the first chapter, the optimization was performed on all the levels mentioned above. The development of a biocatalytic process on the multi-dozen gram scale for the synthesis of a precursor to Nylon-9, a specialty polyamide, was established. Such materials are growing in demand, but their corresponding monomers are often difficult to synthesize, giving rise to biocatalytic approaches. Here,the cyclopentadecanone monooxygenase as an Escherichia coli (E. coli) whole-cell biocatalyst was chosen as a catalytic entity and produced in a stable expressing system (biocatalyst level) in a defined medium, which was optimized prior to upscaling (cultivation level). Together with the implementation of a substrate feeding-product removal concept, an DSP was established (process/DSP level). A previously described hazardous peracid-mediated oxidation was thus replaced with a safe and scalable protocol, using aerial oxygen as oxidant and water as reaction solvent. The engineered process converted 42 g (0.28 mol) starting material ketone to the corresponding lactone with an isolated yield of 70 % (33 g), after highly efficient DSP with 95 % recovery of the converted material, translating to a volumetric yield of 8 g pure product per liter. Subsequently, the possibility of optimization on whole-cell biocatalyst level was investigated. A kinetic model for the simulation and optimization of an in vivo redox cascade in E. coli, using a combination of an alcohol dehydrogenase, an enoate reductase, and a Baeyer-Villiger monooxygenase (CHMO) for the synthesis of lactones was developed. The model was used to estimate the concentrations of active enzyme in the sequential biotransformations to identify bottlenecks together with their reasons and how to overcome them. The adapted Michaelis-Menten parameters from in vitro experiments with isolated enzymes were estimated, and these values were used to simulate the change in concentrations of intermediates and products during the in vivo cascade reactions. The model indicated the CHMO, the fastest enzyme, to be rate-determining due to the low concentration of the active form, opening up reversible reaction channels towards side products. Substantial experimental evidence was provided, that a low intracellular concentration of flavin and nicotinamide cofactors drastically throttled the performance of the in vivo cascade. As a next step, the performance of the CHMO in a whole-cell catalyst was investigated to obtain knowledge about its poor performance in vivo and to propose optimization strategies (catalyst level). The measurement of in vivo activity and stability of the CHMO in the recombinant host E. coli was performed. This enzyme was often described as poorly stable in vitro, and has recently been found to deactivate rapidly in the absence of its essential cofactors and of anti-oxidants. Additionally, it was identified as the rate limiting step of an enzymatic cascade in the previous chapter. Its stability in vivo was scarcely studied, so far. The activity and stability of CHMO in E. coli during common conditions for over-expression was measured, and the ability of the host to support these properties by metabolomics analyses was investigated. The results showed that E. coli failed to provide the intracellular levels of cofactors required to functionally stabilize CHMO, although the biocatalyst was produced in high concentration, and was invariably detectable after protein synthesis had stopped. Biotechnological applications in this host possibly relied on a residual activity of approx. 5 %. Other microorganisms might thus offer a more efficient solution for recombinant production of CHMO, and related enzymes. As the last optimization step on the catalyst and cultivation level, an in vivo characterization of dihydroxyacetone kinase (DhaK) expressed in E. coli was presented with regard to physiological and metabolical changes compared to E. coli wt strain. This enzyme can facilitate aldol reactions in vivo by increasing intracellular dihydroxyacetone phosphate (DHAP, aldol donor molecule) concentrations. The DhaK phosphorylates dihydroxyacetone (DHA) to DHAP by consuming ATP. Overall, despite the metabolic burden of plasmid maintenance and protein expression, the DhaK strain showed similar physiological behavior compared to the wt strain. In contrast to E. coli wt, the DhaK strain took up DHA during the exponential growth phase and showed higher intracellular concentrations of DHAP. Metabolomics analysis also indicated that the pool of ATP, which is needed for the enzymatic phosphorylation of DHA, was too low under non-growing conditions, so that the reaction could only proceed during exponential growth. Modeling both strains revealed the possibility of bypassing the upper glycolysis by expressing DhaK and feeding DHA, which needs to be investigated further with carbon source 13C labeling by dynamic metabolomics approaches. In summary, the presented system was modeled together with an aldol producing enzymatic cascade in E. coli and was found to be of benefit for DHAP-dependent aldol reactions in silico. The combination of the different levels of optimization applied in this theses - accompanied by the methods modeling, metabolomics and optimizational tools for reaction design - were successfully applied to facilitate biotransformations in living systems.