Mise au point d'une technique d'immunohistochimie multiplex quantitative pour l'analyse du microenvironnement immunitaire tumoral

Le contexte immunitaire influence la progression tumorale et le devenir des patients sous thérapies antitumorales. Plus précisément, le microenvironnement tumoral (TME) influence la progression des tumeurs et est désormais la cible des nouvelles immunothérapies. L’étude de cet environnement est désormais indispensable pour accompagner les traitements des patients. L’objectif de cette étude est de développer et d’évaluer des panels d’immunohistochimie (IHC) multiplex pour analyser le TME. L’IHC multiplex peut permettre d’analyser la complexité du TME et d’étudier directement in situ les interactions entre les nombreuses populations cellulaires qui le composent. Dans cette étude préliminaire, nous avons développé un panel pour l’analyse des lymphocytes infiltrants la tumeur (TIL), et réalisé une évaluation de la méthode d’analyse des images. La méthode utilisée est une IHC multiplex révélée en immunofluorescence (IF) avec le système d’amplification du signal à la tyramide (TSA) développé par Perkin Elmer sous le nom de système Opal suite à un partenariat. Cette technologie a été notamment adaptée sur l’automate Leica BOND RXm utilisé pour cette étude. Pour l’analyse des TIL, nous avons développé un panel CD4, CD8 et CD20 permettant de cibler respectivement les lymphocytes T helper, T cytotoxiques et B. Après l’IF multiplex et le scan des lames, les marqueurs ont été quantifiés par analyse d’image en utilisant le logiciel CaloPix de Tribvn. La méthode d’analyse a été évaluée en étudiant la justesse des résultats quantitatifs obtenus en multiplex par rapport aux analyses simples et la reproductibilité du process, réalisé par plusieurs opérateurs. Ces analyses ont été faites sur plusieurs types tumoraux : cancer du poumon (NSCLC), du sein (BC) du pancréas (PC), du cerveau, un glioblastome (G) et un cancer du foie (HCC). La variabilité induite par la nature de l’échantillon a également été adressée. Résultats : Nous avons observé que la justesse de l’analyse multiplex est impactée par le type tumoral étudié. Une bonne correspondance entre les simplex et le multiplex est observée pour les BC, PC et NSCL, mais est plus difficile à obtenir pour le Glioblastome et le HCC. La reproductibilité est également impactée par la nature du tissu. Ces premiers résultats montrent que la standardisation de la méthode d’analyse reste à parfaire pour diminuer ces variations. 163 Revue Française d’Histotechnologie 2018 - Vol. 30 - n°1 En conclusion, le développement de nouveaux biomarqueurs in situ est fondamental pour comprendre le fonctionnement du microenvironnement tumoral et des nouveaux produits d’immunothérapie. Nous décrivons ici un exemple de développement d’IHC multiplex quantitative, outil qui sera essentiel pour analyser le système immunitaire in situ et pour accompagner les traitements des patients. Nous soulignons également que les méthodes d’analyses de ces IHC nécessiteront des process de validations à ne pas négliger avant une utilisation automatisée.
Immune background influences cancer progression and clinical outcome of patients. The tumor microenvironment (TME) is the bed of cancer progression and the target of developing drugs. The objective of this work is to develop and evaluate multiplex ImmunoHistoChemical (IHC) panels to analyze the immuno-phenotype of human cancer TME. Multiplex IHC can be used to analyze the complexity of TME and to study directly in situ the interactions between the many cellular populations that compose it. We describe here the preliminary work on the analysis of the Tumor Infiltrating Lymphocyte (TIL), and the evaluation of the process we performed on image analysis. Methods of labelling are based on a Tyramide Signal Amplification (TSA) fluorescence (IF) coupled developed by PerkinElmer (Opal® technology) and realized on Leica BOND RXm system. For TIL analysis, we developed a panel composed of CD4, CD8 and CD20 markers allowing to respectively detect T helper, T cytotoxic and B lymphocytes. After multiplex OPAL labelling and slide scanning, quantifications of all markers were performed using CaloPix software from Tribvn. These analyses were performed on human tumors: Non-Small Cell Lung Carcinoma (NSCLC), Breast carcinoma (BC), Pancreatic carcinoma (PC), Glioblastoma (G) and Hepatocellular Carcinoma (HCC). Results: We observed that accuracy of the image analysis method 164 Revue Française d’Histotechnologie 2018 - Vol. 30 - n°1 for TIL quantification was variable depending of the tumor. We observed globally a good concordance between simplex and multiplex quantification in BC, PC and NSCLC. This concordance was more difficult to obtain with G and HCC and further improvements need in the formalization of the analysis process. In conclusion, the development of new in situ biomarkers is fundamental to understand the influence of TME on tumor progression for immunotherapeutic development. We describe here the development of multiplex IHC panel for TIL analysis that will allow the immune “phenotyping” of this TME. We highlight also that the analysis process of theses multiplex IHC will need to be correctly validated before use in an automatic way.