The early part of the mitochondrial Iron-Sulfur-Assembly machinery: Structural and mechanistic insights

Eisen-Schwefel (Fe/S) Cluster sind die ältesten anorganischen Protein-Kofaktoren und ubiquitär in allen Reichen des Lebens vorhanden. Fe/S-Proteine koordinieren häufig essentielle Aufgaben in der Zelle wie z.B. Teile der Zellatmung, der DNA Synthese und der Proteintranslation. Trotz der vergleichsweise einfachen chemischen Struktur und Zusammensetzung von Fe/S-Clustern benötigt die Zelle ein komplexes System für deren Synthese und Einbau in apo-Proteine. Defekte in der Fe/S-Proteinbiogenese sind mit schwerwiegenden Krankheiten, wie z.B. der Friedreich-Ataxie oder der sideroblastischen Anämie verknüpft. Ein besseres Verständnis der Biogenese von Fe/S-Proteinen eröffnet neben dem grundlegenden Verständnis dieses lebenswichtigen Prozesses auch eine eventuelle Behandlung solcher oft lebensbedrohlichen Erkrankungen. In Eukaryoten beginnt die Synthese von Fe/S-Clustern in den Mitochondrien, bzw. in den verwandten Mitosomen. Diese Organellen beherbergen die sog. „iron-sulfur cluster“ (ISC) Assemblierungsmaschinerie. Der frühe Teil der ISC-Maschinerie dient zur Synthese eines [2Fe-2S]-Clusters auf dem Gerüstprotein Isu1, wozu fünf weitere ISC Komponenten benötigt werden. Der Desulfurasekomplex aus Nfs1 und Isd11 liefert dabei den Schwefel, während das Frataxin Yfh1 als Eisendonor und/oder Schwefelüberträger wirkt. Eisen und Schwefel werden schließlich auf Isu1 unter Elektronenzufuhr durch das Ferredoxin Yah1 und seiner Reduktase Arh1 zu einem Fe/S-Cluster zusammengesetzt. In dieser Arbeit konnten mechanistische und strukturelle Einblicke in die Funktion dieser frühen ISC Maschinerie auf molekularer Ebene gewonnen werden. Erstens konnte auf Basis der durch NMR Spektroskopie atomar aufgelösten Strukturen des Ferredoxins Yah1, des Gerüstproteins Isu1 und des Yah1-Isu1 Komplexes gezeigt werden, wie die beiden Proteine interagieren. Daraus konnte ein Vorschlag abgeleitet werden, wie die Elektronenübertragung vom reduzierten Fe/S-Cluster des Ferredoxins zum Isu1 bewerkstelligt wird. Hierbei spielen vor allem strukturelle Veränderungen innerhalb des Yah1 bei der Reduktion eine große Rolle, wobei das essentielle Histidin 51 als „Elektronenbrücke“ fungieren könnte. Zweitens konnten biochemische Untersuchungen der Interaktionen aller frühen ISC-Faktoren mittels Thermophorese zu einem zeitlich aufgelösten Modell des Mechanismus der initialen Fe/S-Cluster Biogenese beitragen. Es konnte gezeigt werden, dass alle primären ISC-Faktoren miteinander interagieren und den biosynthetischen Komplex bilden. Dieser ist vom Redoxzustand der Komponenten und der Anwesenheit von Fe(II) und Cystein abhängig. Schließlich konnte auf Basis von SAXS-Daten (SAXS: small angle X-ray scattering) die Gesamtstruktur der frühen ISC-Maschinerie ermittelt werden. Dadurch konnte der frühe ISC-Komplex als Dodekamer mit folgender Stöchiometrie definiert werden: 2(Nfs1+2Isd11+Yfh1+Isu1+Yah1). Diese strukturellen Daten erlaubten trotz der relativ niedrigen Auflösung erstmals weitreichende Rückschlüsse auf den molekularen 9 Mechanismus der Fe/S-Cluster Biogenese. Der Komplex aus Yah1 und Isu1 ist in räumlicher Nähe zum essentiellen Persulfid-tragenden Cysteinrest des Nfs1 lokalisiert, und ermöglicht damit räumlich eine Persulfidübertragung von Nfs1 auf Isu1. Anschließend kann das Persulfid durch Yah1 reduziert werden. Die bereits vorgeschlagene Funktion des Frataxins Yfh1 als Eisendonor konnte aufgrund seiner Lage im ISC-Komplex und im Speziellen der Position seines konservierten Histidins 23 weiter untermauert werden. Auch die Lage von Isd11 auf Nfs1 konnte erstmals gezeigt werden. Isd11 bindet weit vom aktiven Zentrum des Komplexes entfernt, befindet sich aber in unmittelbarer Nähe zum aktiven Zentrum des Nfs1 und der Cysteinbindestelle. Dies lässt den Schluss zu, dass Isd11 die Aktivität von Nfs1 reguliert. Somit konnte auf molekularer Ebene ein Vorschlag für die Herkunft und die Übertragung sowohl des Schwefels als auch des Eisens gemacht und Einblicke in die Lokalisation von Isd11 auf Nfs1 gewonnen werden. Zusammen genommen bilden diese Ergebnisse einen wichtigen Schritt in Richtung des molekularen Verständnisses der Fe/S-Cluster Biogenese und damit auch die Basis für weitere Untersuchungen.
Iron-sulfur (Fe/S) clusters are ancient protein cofactors and ubiquitously present in all kingdoms of life. Fe/S-proteins coordinate essential functions within the cell, e.g. cellular respiration, DNA-synthesis and protein translation. Despite the relatively simple chemical structure and composition of Fe/S-clusters, the cell requires a complex system for their synthesis and incorporation into apo-proteins. Deficiencies in Fe/S-protein biogenesis are often linked with severe metabolic defects and serious diseases such as Friedreich‘s ataxia or sideroplastic anemia. A better understanding of the biogenesis of Fe/S-proteins may help to find new therapies for such life-threatening diseases. In eukaryotes, the synthesis of Fe/S-clusters starts inside mitochondria (or related organelles such as mitosomes). These organelles contain the so-called „iron-sulfur-cluster“ (ISC) assembly machinery. The early part of the ISC-machinery accomplishes the synthesis of a [2Fe-2S]-cluster on the scaffold protein Isu1 which requires five additional factors. The desulfurase complex Nfs1/Isd11 delivers the sulfur while the frataxin Yfh1 serves as an iron-donor and/or sulfur-carrier. The so provided iron and sulfur will finally be assembled to an Fe/S-cluster. The assembly process depends on an electron supply by the ferredoxin Yah1 and its reductase Arh1. In this study, additional mechanistic and structural insights into the early ISC-machinery were gained at a molecular level. First, it was shown how the two proteins interact, based on the atomic structures of Yah1, Isu1 and the Yah1-Isu1 complex solved by NMR-spectroscopy. This revealed a possible mechanism for the electron transfer from the reduced Fe/S-cluster of Yah1 to Isu1. Therefore, the structural changes of Yah1 upon reduction play a major role while the essential His51 may have an electron-bridging function. Second, biochemical studies of the interactions of all early ISC factors by Thermophoresis contributed to a time-resolved model of the mechanism of the initial Fe/S-cluster biogenesis. All primary ISC factors interact with each other and form a biologically competent complex, which is dependent on both the redox-state of the components and the presence of Fe(II) and cysteine. Finally, the overall structure of the early ISC-machinery was determined by SAXS (small angle X-ray scattering). This allowed the early ISC complex to be defined as a dodecamer having the following stoichiometry: 2(Nfs1+2Isd11+Yfh1+Isu1+Yah1). These structural data, despite the relatively low resolution, allowed new insightful conclusions about the molecular mechanism of Fe/S-cluster biogenesis. The Yah1-Isu1 complex is located in close proximity to the essential persulfide-bearing cysteine residue of Nfs1, and thus enables a persulfide-transfer from Nfs1 to Isu1. Then the persulfide can be reduced by Yah1. The previously proposed function of the frataxin Yfh1 as an iron-donor was further substantiated due to its localization within the ISC-complex and in particular the position of its conserved histidine 23. For the first time the location of Isd11 on Nfs1 could be shown. Isd11 binds far away from the active site of the ISC-complex, but is located in close proximity to the active site of Nfs1 and its cysteine binding pocket. This leads to the conclusion that Isd11 may regulate the activity of Nfs1. Thus, these data offer an explanation for the origin and the transfer mechanism of both the iron and the sulfur on a molecular basis and suggest a possible location of Isd11 on Nfs1. Taken together, these results constitute an important step in the direction of the molecular understanding of the Fe/S cluster biogenesis and therefore also form the basis for further investigations.