An Assay for the Activity of Base Excision Repair Enzymes in Cellular Extracts Using Fluorescent DNA Probes: ACTIVITY OF BASE EXCISION REPAIR ENZYMES

International audience; Damaged DNA bases are removed by the base excision repair (BER) mechanism. This enzymatic process begins with the action of one of DNA glycosylases, which recognize damaged DNA bases and remove them by hydrolyzing N-glycosidic bonds with the formation of apurinic/apyrimidinic (AP) sites. Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) hydrolyzes the phosphodiester bond on the 5′-side of the AP site with generation of the single-strand DNA break. A decrease in the functional activity of BER enzymes is associated with the increased risk of cardiovascular, neurodegenerative, and oncological diseases. In this work, we developed a fluorescence method for measuring the activity of key human DNA glycosylases and AP endonuclease in cell extracts. The efficacy of fluorescent DNA probes was tested using purified enzymes; the most efficient probes were tested in the enzymatic activity assays in the extracts of A549, MCF7, HeLa, WT-7, HEK293T, and HKC8 cells. The activity of enzymes responsible for the repair of AP sites and removal of uracil and 5,6-dihydrouracil residues was higher in cancer cell lines as compared to the normal HKC8 human kidney cell line.; Les bases d'ADN endommagées sont éliminées par le mécanisme de réparation par excision de base (BER). Ce processus enzymatique commence par l'action d'une des glycosylases de l'ADN, qui reconnaît les bases d'ADN endommagées et les élimine en hydrolysant les liaisons N-glycosidiques avec la formation de sites apuriniques/apyrimidiniques (AP). L'endonucléase 1 apurinique /apyrimidinique (APE1) hydrolyse la liaison phosphodiester du côté 5′ du site AP avec la génération de la rupture de l'ADN simple brin. Une diminution de l'activité fonctionnelle des enzymes BER est associée à un risque accru de maladies cardiovasculaires, neurodégénératives et oncologiques. Dans ce travail, nous avons développé une méthode de fluorescence pour mesurer l'activité des principales glycosylases de l'ADN humain et de l'endonucléase AP dans les extraits cellulaires. L'efficacité des sondes d'ADN fluorescentes a été testée en utilisant des enzymes purifiées ; les sondes les plus efficaces ont été testées dans les essais d'activité enzymatique dans les extraits de cellules A549, MCF7, HeLa, WT-7, HEK293T, et HKC8. L'activité des enzymes responsables de la réparation des sites AP et de l'élimination des résidus d'uracile et de 5,6-dihydrouracile était plus élevée dans les lignées de cellules cancéreuses que dans la lignée normale de cellules rénales humaines HKC8.Traduit avec www.DeepL.com/Translator (version gratuite)