Оптимизация иммуноферментного метода для определения цилиарного нейротрофического фактора в слезной жидкости человека

The concentration of ciliary neurotrophic factor (CNTF) was measured in lacrimal fluid (LF) using Human CNTF Quantikine ELISA kit (“R&D Systems”, USA) on a ChemWell 2910 automatic analyzer (“Awareness Technology Inc.”, USA). We initially attempted to use commercial kits, designed for serum and plasma CNTF detection, to quantify lacrimal CNTF. The results, however, were rarely above the minimum detection level of the kits, most likely due to matrix complexity and low concentrations of CNTF in diluted LF (LF had to be diluted because of the small volume of collected samples). The optimal sensitivity and the lowest background for the best minimum quantifiable value were determined empirically. Phosphate buffer solution containing 1% bovine serum albumin was selected as an optimal diluent for CNTF measurements in small fluid samples. A standard curve was produced using the calibrating solutions 0-250 pg/ml. Acid treatment of LF samples before the analysis allowed to increase the detectable concentration of the CNTF two-fold. The 1:3 dilution was selected based on the available volume of collected LF and a reasonable variation coefficient. The described protocol allowed to develop a sandwich ELISA optimized for lacrimal CNTF.
Определение цилиарного нейротрофического фактора – ciliary neurotrophic factor (CNTF) в слёзной жидкости (СЖ) человека рутинными лабораторными методами затруднено из-за его низкой концентрации в структурах глаза и недостаточного количества материала для анализа. Были подобраны условия для определения CNTF в СЖ твердофазным методом иммуноферментного анализа (ИФА) на основе набора Human CNTF Quantikine ELISA Kit (“R&D Systems”, США) с использованием автоматического иммуноферментного анализатора ChemWell 2910 Combi (“Awareness Technology Inc.”, США). Предварительная кислотная обработка проб СЖ позволила вдвое повысить концентрацию CNTF. Полностью автоматизированная система проведения анализа и выбор разбавителя с низкой оптической плотностью бланка (0.011) обеспечили линейную зависимость калибровочного графика от 0 до 250 пг/мл с возможностью его использования для расчета концентрации CNTF в области низких значений. Рабочие характеристики оптимизированной тест-системы ИФА (линейность метода, предел обнаружения, воспроизводимость, интерференция матрицы) в указанном диапазоне концентраций соответствовали критериям приемлемости для используемого метода определения. Разведение образцов СЖ в четыре раза, совмещённое с кислотной обработкой проб, оказалось оптимальным для получения стабильных результатов при проведении анализа. В этом случае концентрация CNTF в пробе составляла в среднем 10.4±0.4 пг/мл с коэффициентом вариации 4.2% и близостью определяемых значений к ожидаемым величинам на уровне 104%.