Assessment of Verticillium dahliae Kleb. And Soil Fungal Communities Associated with Strawberry Fields

A Thesis for applying for the degree of Doctor of Philosophy in Agriculture Strawberry (Fragaria × ananassa) is a high value crop, and it is grown for its berries in many countries. Strawberry industry in Estonia has been fluctuating due to the limited selection of cultivars suitable for Nordic climate that are also susceptible to several diseases. Due to the complexity of soil systems and the inadequacy of conventional techniques for describing microbial community composition, it is difficult to diagnose and forecast all ongoing diseases. Strawberry fields are often subjected to disease complex involving different soil-borne pathogens. One of the most widespread and destructive diseases of strawberry is Verticillum wilt caused by Verticillium dahliae. So, knowing about the presence and amount of V. dahliae in the soil can be a key factor in determining appropriate management strategies. The general goal of the present dissertation was on assessment of V. dahliae inoculum density and soil fungal communities associated with Estonian strawberry fields in order to a better understanding of population dynamics. Additionally, finding new potential biocontrol agents was also important in terms of their implications for biological control. In this respect, PCR-based methods used for detection and/or quantification of the most widespread strawberry pathogens were systematically reviewed (I) and then general description of different real-time PCR (rtPCR) chemistries applied in plant pathology was illustrated (II). Also, a rtPCR assay combined with a conventional technique was developed for detection and quantification of V. dahliae directly from strawberry plants and soils of different major production areas (Vasula, Rohu, Unipiha, Utsu, Kaie-Mare and Marjamaa) in Estonia (III, IV). Moreover, soil fungal communities in same strawberry production areas (except Kaie-Mare) were investigated using Illumina-based sequencing as the first study, which may improve available management strategies against strawberry soil-borne diseases (V). Lastly, the antagonistic potential of a native Ttichoderma harzianum collected from Estonian fields as well as Gliocladium catenulatum isolated from a bifungicide toward V. dahliae was assessed with the aim of protecting biological resources (VI, VII). As the first study in Estonia, the newly developed rtPCR protocol efficiently enabled detecting and quantifying V. dahliae in strawberry plants and soils in which, 10.48 pg μl−1 of pathogen DNA represented at least one Microsclerotia (MS) per gram of soil, showing a high level of quantification in comparison with other studies. In fact, the presence of V. dahliae in strawberry production areas exhibited considerable variation, being high in samples from Vasula and Marjamaa, moderate in Rohu and Utsu, and low in Unipiha. No V. dahliae was detected from Kaie-Mare district. According to Illumina sequencing of strawberry soils from five commercially production sites, a high number of sequence matched V. dahliae in most samples particularly from soils with diseased plants (Vasula and Marjamaa) and so proved the interpretation of earlier estimates using rtPCR. Arbuscular mycorrhizal fungi were more abundant in areas with healthy plants (Rohu, Utsu and Unipiha), which may highlight their suppressive role against fungal pathogens. Moreover, biocontrol ability of T. harzianum isolates and G. catenulatum over V. dahlia was proven, representing as useful candidates for biocontrol of one of the most economically important pathogen of strawberry. The current dissertation provided important insights into the rtPCR as a valuable quantitative technique for diagnosis of important pathogens such as V. dahliae with high accuracy and rapidity as well as presented a comprehensive study to date on soil fungal communities in Estonian strawberry fields, which may help to achieve better understanding of the biological characteristics of soil in development of diseases. The data described within this dissertation may provide useful information for growers and agricultural organizations for applying suitable disease management strategies against plant pathogenic. Aedmaasikas (Fragaria × ananassa) on hinnatud marjakultuur, mida kasvatatakse paljudes riikides. Eestis on maasikakasvatuse maht aastate lõikes varieeruv, kuna kohalikule kliimale sobivate ja haiguskindlate sortide valik on piiratud. Paljud mullapatogeenid on maasikahaiguste põhjustajateks. Kõige levinum ja kõige suurema kahju tekitaja on Verticillium dahlia, mis põhjustab närbumistõbe. Maasikahaiguste määramine on keeruline, kuna mulla mikrobioom on kompleksne ja haigustekitajate määramiseks sobivate meetodite valik on piiratud. Parima agrotehnoloogia leidmiseks on vajalik teada V. dahliae kogust mullas. Uurimistöö eesmärgid: 1) Analüüsida PCR-meetodite täpsust ja usaldusväärsust enamlevinud maasika patogeenide kvalitatiivsel ja kvantitatiivsel määramisel (I, II). Hüpotees: PCR-meetodid sobivad maasika patogeenide detekteerimiseks ja identifitseerimiseks, kuid kvantitatiivne reaalaja PCR (rtPCR) on sobilik meetod patogeenide arvukuse määramiseks. 2) Koostada tundlik ja spetsiifiline rtPCR protokoll, et kvantitatiivselt määrata V. dahliae arvukus maasikatest ja mullast Eestis (III). Hüpotees: rtPCR protokoll võimaldab iseloomustada V. dahliae arvukust maasikates ja mullas. 3) Hinnata V. dahliae mikrosklerootiumite arvukust mullas kahe meetodiga, klassikaline morfoloogiapõhise meetodi ja kvantitatiivse rtPCR-iga ja võrrelda saadud tulemusi ((IV). Hüpotees: rtPCR võimaldab kiiremat ja tundlikumat kvantifitseerimist, määrates patogeenid ka terve välimusega taimedes. 4) Iseloomustada Eesti maasikapõldude muldade seenekooslusi järgmise põlvkonna sekveneerimise abil(V). Hüpotees: Järgmise põlvkonna sekveneerimine võimaldab laiaulatuslikke seenekoosluste avastamist. 5) Hinnata G. catenulatum ja T. harzianum isolaatide võimekust kontrollida V. dahliae levikut. Hüpotees: G. catenulatum ja T. harzianum on efektiivsed V: dahliae tõrjel. Metoodika Maasika patogeenide määramiseks kasutatud ja avaldatud PCR protokollidest tehti süstemaatiline ülevaade (I). Süstemaatilise otsingustrateegiaga leiti 22 otsingukriteeriumitele vastavat artiklit. Taime ja mullaproovid koguti aastatel 2014-2015 aedmaasika põldudelt, mis asusid vastavalt Vasula, Rõhu, Unipiha, Utsu, Kaie-Mare ja Marjamaa piirkonnas. Kasvatav maasikasort oli Sonata. Seenpatogeenid ja V. dahliae arvukus määrati juure ristlõikest ja ühest grammist mullast morfoloogiliste tunnuste alusel (III, IV, V, VI). G. catenulatum eraldati biopreparaadist Prestop® (VII). Kõikide V. dahliae isolaatide patogeensus testiti kahe meetodiga: juurte ja mulla inokulatsiooniga (VI). DNA eraldati puhaskultuuridest, taimedest ja mullast ning selle kvaliteeti kontrolliti cPCR abil (ITS1/ITS4 praimeritega). V. dahliae kvantifitseerimiseks disainiti vastavad praimerid (VD-rtPCR-F/VD-rtPCR-R) (III, IV). Reaalaja PCR protokolliga (CYBRGreen reaktsioonikeemiaga) kvantifitseeriti V. dahliae. Patogeeni DNA kontsentratsiooni määramise standardkõvera amplifitseerimise efektiivsus oli 95.67% ja kõige madalam amplifitseeritud DNA kontsentratsioon 0.93 pg μl−1 (III, IV). Uue põlvkonna sekveneerimise meetodit rakendati seenekoosluste iseloomustamiseks, amplifitseerides ja järjestades ITS1 regiooni seene rRNA geenis (V). Mullast eraldatud T. harzianum ja biofungitsiidist eraldatud G. catenulatum isolaatide patogeeni allasurumisevõimet testiti in vitro ja in vivo (VI, VII). Statistilised analüüsid teostati R programmiga ja varieeruvusanalüüsid (ANOVA) programmiga MSTATC (v. 1.42). Tulemused ja arutelu Süstemaatiliselt koguti ja analüüsiti kõik maasika patogeenide määramiseks seni kasutatud PCR-põhised meetodid, täpsemalt iseloomustati rtPCR protokolle (I, II). Kogutud info alusel töötati välja rtPCR protokoll, millega määrati kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt Eesti suuremate maasikatootjate põldudelt (Vasula, Rõhu, Unipiha, Utsu, Kaie-Mare and Marjamaa) kogutud mulla ja taime proovidest V. dahliae sisaldus (III, IV). Kasutatud ITS regiooni spetsiifilised praimerid on laialt kasutusel patogeenide määramiseks (Lees et al. 2002; Luchi et al. 2005). Tõestust leidis ka ITS praimerite kõrge spetsiifilisus V. dahliae määramisel väga heterogeensest proovist. rtPCR võimaldas määrata isegi terve välimusega taimedes 11.05 pg μl−1 patogeeni DNA-d. See näitab, et paljud taimed võivad olla haigustekitaja varjatud kandjad (Markakis et al. 2009). Kasutades soil plating meetodit, leiti et V. dahlie arvukus varieerus ühes grammis mullas 1 kuni 13 mikrosklerootiani. Teiste meetoditega võrreldes oli rtPCR meetod väga kõrge tundlikkusega, sest 10.48 pg μl−1 patogeeni DNA-d leiti proovidest, mis klassikalise meetodiga ühtegi tulemust ei andnud. V. dahliae kontsentratsioon maasika tootmispõldudel oli väga varieeruv. Vasula ja Marjamaa proovides oli haigustekitaja sisaldus väga kõrge, Rõhu ja Utsu proovides oli see keskmine ja Unipiha proovides madal. Kaie-Mare piirkonnast ei tuvastatud ühtegi V. dahlia patogeeni. Lisaks iseloomustati mulla seenekooslusi uue põlvkonna sekveneerimise abil (V). Identifitseeriti palju taksonoomiliselt erinvaid seenerühmi. Kõige rohkem esines rühmi Ascomycota ja Basidiomycota (V), mis on ühtlasi ka üle maailma kõige enamesindatud seened mullas (Gomes et al., 2003). Tulemused kinnitasid rtPCR protokolliga saadud tulemusi ja kõige rohkem V. dahlia järjestusi leiti muldadest, kus oli palju haigustunnustega taimi (Vasula ja Marjamaa). Lisaks leiti teisi maasikapatogeene: F. solani, R. solani ja C. truncatum. Arbuskulaarsete mükoriisaseente (Rhizophagus irregularis ja Glomus hoi) sisaldus oli kõrgem seal, kus domineerisid terved taimed (Rõhu, Utsu ja Unipiha), mis ilmselt viitab mükoriisaseente võimele haigustekitajaid alla suruda (Nallanchakravarthula et al., 2014). Samas on leitud, et vastupidi, arbuskulaarsete mükoriisaseente arvukus ei pruugi alati taimede haigustele vastuvõtlikkust mõjutada (Xu et al., 2012b). Edasine uurimistöö peab analüüsima keskkonna rolli taime haigestumisel. Analüüsiti Eesti põllumullast eraldatud Trichoderma harzianum ja biofungitsiidist eraldatud Gliocladium catenulatum isolaatide potentsiaalset negatiivset mõju V. dahliae kasvule (VI, VII). Leiti, et T. harzianum ja G. catenulatum olid võimelised V. dahlia kasvu pärssima in vitro ja in vivo, mis teeb neist head kandidaadid maasika patogeenide biotõrjeks. Leiti, et mõlemad isolaadid sünteesisid erinevaid lenduvaid ja mittelenduvaid metaboliite, mille negatiivne mõju takistas V. dahliae mütseelkasvu (mycelial growth). Varasemalt on samuti leitud, et T. harzianum toodab erinevaid antibiootilise toimega metaboliite, mis inhibeerivad taime patogeenide kasvu (Siddiquee et al., 2012). Järeldused • PCR protokollid võimaldavad maasika patogeene tuvastada; neist rtPCR protokoll on kõige lootustandvam meetod, mis võimaldab enamlevinud maasika patogeene määrata kvalitatiivselt ja kvantitatiivselt (I, II). • Välja töötatud rtPCR protokoll võimaldas efektiivselt ja täpselt määrata ja kvantifitseerida V. dahliae sisaldust nii maasika taimedes (nii haigussümptomite kui ka ilma sümptomita taimedes) kui ka mullas (III, IV). • V. dahliae DNA kontsentratsioon 10.48 pg μl−1 vastab ühele mikrosklerootiale grammis mullas (IV). • Uue põlvkonna sekveneerimise rakendamine võimaldas iseloomustada maasikapõldude mulla seenekooslusi (V). Mida rohkem oli haigustunnustega taimi, seda rohkem esines mullas V. dahliae järjestusi. • Arbuskulaarsete mükoriisaseente sisaldus oli kõige kõrgem neis mullaproovides, mis oli kogutud põldudelt, kus olid valdavalt terved taimed (Rõhu, Utsu ja Unipiha), viidates nende võimalikule rollile haigustekitajate tagasitõrjumisel (V). • Mullast eraldatud T. harzianum ja biofungitsiidist eraldatud G. catenulaum olid võimelised takistama V. dahliae kasvu nii in vitro, kui in vivo, mis tähendab, et neil on potentsiaali biotõrjes. Käesoleva doktoritöö tulemused näitasid V. dahlia näitel, et rtPCR meetod on tundlik ja täpne maasika patogeenide kvantitatiivseks määramiseks. Töös iseloomustati ka Eesti maasikapõldude seenekooslusi, mis on tähtis, et mõista paremini mulla bioloogia rolli haiguste tekkimisel ja arenemisel. T. harzianum ja G. catenulaum osutusid headeks biofungitsiidideks, mis võimaldasid V. dahliae kasvu pidurdada. Saadud tulemused aitavad maasikakasvatajal paremini määrata põllul haigustekitajaid, mis aitavad kiiremini ja täpsemini valida sobivaid võtteid patogeenide kontrolli all hoidmiseks. Publication of this dissertation is supported by the Estonian University of Life Sciences, Ministry of Education and Research and the Doctoral School of Earth Sciences and Ecology.