Study of the immobilization of Leishmania infantum antigens on organized platforms using SPR and QCM for the detection of specifics antibodies of the Visceral Leishmaniasis

Orientador: Lauro Tatsuo Kubota Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: A leishmaniose é referida pela organização mundial da saúde como uma das principais doenças parasitárias, acometendo cerca de 2 milhões de pessoas anualmente em 98 países diferentes. A leishmaniose visceral (LV) é a forma mais grave e devido às limitações dos ensaios convencionais (ELISA, por exemplo) utilizados para seu diagnóstico, grandes motivações estão voltadas ao desenvolvimento de novas metodologias para detecção dessa parasitose. No presente trabalho, as técnicas de ressonância de plásmons de superfície (SPR) e microbalança de cristal de quartzo (QCM) foram utilizadas no desenvolvimento de imunossensores para detecção de anticorpos específicos da LV. Em relação à etapa de funcionalização de superfícies metálicas durante a construção dos biossensores, maior eficiência foi observada através de plataformas multivalentes formadas por dendrímeros ou dendrons combinados ou não a monocamadas auto-organizadas (SAMs) de alcanotióis. Nesta etapa, destaca-se a síntese orgânica de um dendron inédito do tipo HS-dendron-(PEG-COOH)9. Em relação à caracterização dos biossensores, enfatiza-se uma abordagem particularmente adotada pelo nosso grupo, através da qual foi possível mediante curvas de refletância de SPR obtidas em diferentes comprimentos de onda (670 e 785 nm) determinar simultaneamente a espessura (4,64 nm) e o índice de refração (1,475) de uma proteína recombinante quimérica imobilizada sobre o substrato sensor. Através de estudos cinéticos, foi possível mensurar o potencial antigênico de novas proteínas de L. infantum, verificando elevada afinidade de ligação de duas proteínas (KD = 8,27 x 10-10 mol L-1 para a proteína quimérica recombinante (CP10); e KD1 x KD2 = 1,64x10-7 mol L-1 para a proteína recombinante hipotética C1) frente a anticorpos específicos da LV. Tais resultados, somados à capacidade de detecção de casos assintomáticos (> 80%) observados nos ensaios de ELISA, evidenciaram a viabilidade de aplicação dessas proteínas no imunodiagnóstico da LV. Análises com amostras reais (soros caninos) apontaram vantagens dos biossensores de SPR e QCM em relação aos testes convencionais, tais como, maior sensibilidade, especificidade, rapidez e a não necessidade de marcação. Portanto, os resultados obtidos neste trabalho de tese são substanciais para contribuição significativa no diagnóstico e programas de controle da LV Abstract: Leishmaniasis is referred to by the world health organization as one of the main parasitical diseases, affecting approximately 2 million people annually in 98 different countries. The visceral leishmaniasis (VL) is the most serious form of the disease and due to the limitations of the conventional assays (ELISA, for example) used for its diagnosis, high motivations are turned to the development of new methodologies for the detection of this parasitosis. In this current work, the techniques of surface plasmon resonance (SPR) and quartz crystal microbalance (QCM) were used in the development of immunosensors for the detection of specific antibodies of VL. Regarding the step of functionalization of metallic surfaces during the construction of the biosensors, a higher efficiency was observed through multivalent platforms formed by dendrimers or dendrons combined or not to self-assembled monolayers (SAMs) of alkanethiols. In this step, emphasis is given to the organic synthesis of an unprecedented dendron of the type HS-dendron-(PEG-COOH)9. With respect to the characterization of the biosensors, an approach adopted particularly by our group is highlighted, by which it was possible, using reflectance curves of SPR obtained at different wavelengths (670 and 785 nm), to determine simultaneously the thickness (4,64 nm) and the refractive index (1,475) of a recombinant chimeric protein immobilized on the sensor substrate. Through kinetic studies, it was possible to measure the antigenic potential of new proteins of L. infantum, verifying high bonding affinity of two proteins (KD = 8,27 x 10-10 mol L-1 for the recombinant chimeric protein (CP10); and KD1 x KD2 = 1,64x10-7 mol L-1 for the recombinant chimeric protein C1) towards specific antibodies of the VL. Such results, added to the capacity of detection of asymptomatic cases (> 80%) observed in the ELISA assays, gave evidence to the viability of the application of these proteins in the immunodiagnostics of the VL. Analyses with real samples (canine serums) pointed out advantages of the SPR and QCM biosensors when compared to conventional tests, such as higher sensitivity, specificity, speed and the fact that marking is not necessary. Therefore, the results obtained in this thesis work are substantial for significant contribution in the diagnosis and control programs of VL Doutorado Química Analítica Doutor em Ciências FAPESP 2012/24493-3