Novos substratos do receptor de insulina : regulação da proteina SHC em modelos animais de resistencia a insulina e do IRS-3 em celulas beta pancreaticas

Orientador: Mario Jose Adballa Saad Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A insulina inicia seus efeitos metabólicos e promotores de crescimento através da ligação à subunidade a do seu receptor. Esta ligação promove a fosforilação em tirosina da subunidade _, e dá inicio a uma cascada de eventos intracelulares, mediante a fosforilação de vários substratos endógenos. Entre os primeiros substratos ativados estão o substrato 1 do receptor de insulina, e uma nova proteína, possuidora .do domínio SH2, cuja estrutura lembra àquela do colágeno (Src homology), denominada Shc. No presente estudo, determinamos a capacidade do receptor de insulina ativado de induzir a fosforilação em tirosina da proteína Shc, assim como a associação Shc-Grb2 em figado, músculo e tecido adiposo de ratos nonnais e ratos submetidos a cinco situações experimentais de resistência à insulina i.e., jejum prolongado, tratamento crônico com dexametasona, envelhecimento, tratamento agudo com adrenalina e diabetes induzida por estreptozotocina. Os resultados demonstraram que após infusão de concentrações fisiológicas de insulina em ratos nonnais, a Shc é substrato do receptor de insulina, cujo pico ,Ae fosforilação acontece 5 minutos após a infusão de insulina nos três tecidos estudados, e se associa à Grb2. Ratos em jejum, uma situação aguda de resistência à insulina que cursa com baixos níveis de glicose e insulina plasmáticas, apresentaram significativa diminuição do grau de fosforilação da Shc induzi da por insulina em figado (50%) e gordura (62%), em relação aos seus controles. Por outro lado, a infusão de insulina em ratos portadores de diabetes mellitus induzida por estreptozotocina, estado caracterizado por apresentar elevados níveis de glicose sanguínea associados a baixas concentrações de insulina plasmática, levou a um significativo incremento do grau de fosforilação da. Shc em figado (175%), músculo (180%) e gordura (133%), em relação aos controles (100%). Embora ambos os modelos experimentais apresentaram baixos níveis de insulina plasmática, as características de fosforilação da Shc foram opostas. Este resultado sugere que em modelos agudos de resistência à insulina, a concentração plasmática de glicose circulante é o principal parâmetro que determina a indução da fosforilação da proteína Shc nos tecidos estudados. Não foi observada variação nos níveis de fosforilação em tirosina em figado, músculo ou gordura de ratos tratados agudamente com adrenalina após estímulo com insulina, embora um aumento estatisticamente significativo nos níveis basais de associação Shc/Grb2 foi evidenciada nos três tecidos estudados nestes anImais. Em animais portadores de hiperinsulinemia crônica (ratos velhos ou tratados com dexametasona), houve um aumento da fosforilação em tirosina da Shc induzida por insulina nos tecidos hepático (64% e 58%) e muscular (81 % e 64%) de ratos com 20 meses ou tratados com glicocorticoides, respectivamente. Em ratos velhos, incremento foi evidenciado também em tecido adiposo (76% acima do controle). Estes resultados sugerem que, em situações crônicas de resistência à insulina, a hiperinsulinemia pode ser um dos fatores responsáveis do aumento de fosforilação da Shc observada nestes animais. Para todos os tecidos e modelos experimentais estudados, esta regulação demonstrou ser independente dos níveis protéicos da proteína Shc, que permaneceram inalterados, mas o grau de fosforilação em tirosina parece detenninar a capacidade de associação da Shc com a proteína adaptadora Grb2. Nossos resultados demonstram que, em tecidos animais, a Shc é susceptível de ser tirosino-fosforilada pela insulina através do seu receptor. Esta fosforilação é tempo- e dose- dependente, e sua intensidade determina as capacidade. De associação da Shc com a proteína adaptadora Grb2. Tanto o grau de fosforilação da Shc quanto a associação Shc/Grb2, apresentam regulação diferenciada, dependente do modelo de resistência à insulina e do tecido analisado, mas parece que os níveis de insulina podem contribuir para essa regulação. A fosforilação da Shc induzida pela insulina nos modelos descritos, apresentou características diferentes daquelas exibidas pelo substrato-l do receptor de insulina, observadas em estudos prévios realizados em ratos sujeitos a idênticas condições experimentais, sugerindo uma dissociação no padrão de comportamento destas duas proteínas, após serem ativadas pela insulina Abstract: Shc is a novel type of tyrosine-phosphory lated protein activated in response to a wide variety of polypeptide ligands. In this report, we used immunoprecipitation and immunoblotting to examine the effect of insulin on Shc tyrosine phosphorylation and Shc/Grb2 association in insulin-sensitive tissues of the intact rat. Following an infusion of insulin, Shc was tyrosine phosphorylated in the liver, skeletal musc1e and adipose tissue in a time- and dose-dependent fashion, which peaked 5 min after exposure to the hormone and, except in the case of adipose tissue, retumed to basal values after 15 mino There was coimmunoprecipitation of Shc and the insulin receptor after stimulation with insulin. Receptor tyrosine kinase activity toward Shc was also observed. Following an infusion ofinsulin, Shc was found to associate with Grb2. Insulin-induced Shc phosphorylation and Shc/Grb2 association were also investigated in five animal models of insulin resistance (72-h starvatation, chronic dexamethasone treatment, aging, acute epinephrine treatment and STZ induced diabetes mellitus). There were no differences in Shc protein expression between tissues from control and insulin resistant animaIs. In all the tissues and animal models studied, the Shc/Grb2 association were directly correlated with the levels of Shc phosphorylation reached after insulin infusion. In fasted hypoinsulinemic rats th_re was a d_crease in insulin-induced Shc phosphorylation in liver and adipose tissue. However, a significant increase _n Shc phosphorylation was observed in liver, musc1_ and fat from STZ-treated rats, another insulin-resistant state wh.ich cóúrses with low insulin levels, but high plasmatic glucose concentrations. Other insulin-resistant states which courses with hyperglicemic levels like dexamethasone-treated rats and aging, showed similar results to those observed in diabetic rats. Liver and musc1e of hypercortisolemic rats showed a significant increase in insulin-induced Shc tyrosine phosphorylation, so as liver, musc1e and adipose tissue of 20 months-old rats. Interestingly, acute stimulus with epinhephrine, a normoglicemic condition, did not display changes in insulin-induced Shc tyrosil phosphorylation nor Shc/Grb2 association in the three tissues studied. These results indicate that Shc tyrosil phosphorylation and Shc/Grb2 association are regulated in the different type af insulin resistance and that this regulation seems to be related to the plasmatic glucose and insulin levels found in these animals Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular