Expression, purification, conformational and functional characterization of HSPH1, a human HSP110 co-chaperone, with emphasis on its role in protein disaggregation systems

Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: O enovelamento incorreto de proteínas pode ocasionar diversas doenças e até mesmo o envelhecimento. Ele pode levar à perda de função das proteínas ou acarretar na formação de agregados proteicos amiloidogênicos, os quais estão envolvidos com diversas doenças. Para se proteger desses agregados, diversos organismos expressam chaperonas moleculares da família Hsp100 (ClpB em bactéria, Hsp104 em levedura e Hsp101 em plantas, por exemplo), que são capazes de desagregar outras proteínas levando à reativação das mesmas. Surpreendentemente, metazoários não possuem um gene para a família da Hsp100. Contudo, estudos recentes mostraram que a co-chaperona Hsp110 tem função desagregase. Dessa forma, o objetivo desta dissertação é caracterizar a HSPH1, uma co-chaperona Hsp110 humana, através da expressão, purificação e caracterização da sua relação estrutura e função. O gene hsph1 clonado no vetor pPROEX-Htb foi expresso na forma solúvel em Escherichia coli (E. coli) BL21(DE3) e a proteína recombinante foi purificada em duas etapas cromatográficas, afinidade e exclusão por tamanho. As análises de espectropolarimetria de dicroísmo circular (CD) determinaram que a HSPH1 foi expressa e purificada enovelada e estável, com estrutura secundária predominante do tipo hélice ?, conservada até 48 ºC e na presença de ureia 3 mol/L. Além disso, a análise da emissão de fluorescência indicou que pelo menos um dos resíduos de triptofano se encontra parcialmente localizado no interior da proteína enovelada. As propriedades hidrodinâmicas (massa molecular, coeficiente de difusão e raio de Stokes), obtidas através das técnicas de cromatografia de gel filtração analítica (GFA), cromatografia de exclusão por tamanho acoplada ao detector multiângulo (SEC-MALS) e espalhamento de luz dinâmica (DLS), mostraram que a HSPH1 se comportou como um monômero com conformação alongada. Finalmente, os experimentos funcionais mostraram que a proteína possui atividade chaperona seletiva, sendo capaz de proteger de maneira diferente proteínas-cliente contra a agregação. Os resultados obtidos têm potencial para acrescentar significativamente ao conhecimento sobre a homeostase proteica na célula, podendo gerar insumos que tenham aplicação médica e biotecnológica Abstract: The incorrect protein folding can cause many diseases and even aging. It can lead to loss of function or to the formation of protein amyloid aggregates, which are involved in several diseases. In order to protect from these aggregates, many organisms express the Hsp100 chaperone (ClpB in bacteria, Hsp104 in yeast and Hsp101 in plants), which is able to disaggregate other proteins leading to their reactivation. Surprisingly, metazoa does not have a gene for the Hsp100. Nevertheless, recent studies have suggested that Hsp110 co-chaperone have disaggregation function. Thus, the aim of this dissertation is to characterize HSPH1, a human Hsp110 co-chaperone, by expressing, purifying and performing structure and functional characterization. The hsph1 gene in pPROEX-Htb vector expressed a soluble protein into Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) and two chromatography steps were used to purify de protein (affinity chromatography followed by size exclusion chromatography). Circular dichroism (CD) and fluorescence emission spectroscopy assays showed that HSPH1 was expressed and purified as a folded and stable protein, with ? helical content of about 34% and it kept its secondary structure content up to about 48 °C and 3 mol/L of urea. Analysis of the emission fluorescence spectroscopy indicated that at least one of the tryptophan residues was partially buried in the native protein. Hydrodynamics properties (molecular mass, diffusion coefficient and Stokes radius) obtained from analytical gel filtration (AGF), size exclusion chromatography combined with multi-angle light (SEC-MALS) and dynamic light scattering (DLS) techniques results suggested that HSPH1 was an elongated monomer. Functional experiments showed that the protein has selective chaperone activity with different protection effects depend on the client-protein tested. The results have the potential to increase significantly the knowledge about protein homeostasis in the cell, which can generate inputs that have medical and biotechnological application Mestrado Química Orgânica Mestra em Química FAPESP 2016/04246-2 CNPQ