Разработка и валидация методики количественного определения силденафила и n-десметил силденафила с помощью ВЭЖХ-МС/МС в плазме крови человека

Цель. Для изучения биоэквивалентности таблетированной формы силденафила (таблетки «Тегрум» 100 мг), производства ООО «НПФ «Микрохим» (г. Рубежное, Украина) был разработан и валидирован быстрый, простой и специфический метод количественного определения концентрации силденафила и его активного метаболита - N-десметил силденафила в плазме крови человека с применением внутренних стандартов, меченных атомами дейтерия. Извлечение аналитов из плазмы крови выполнялось методом прямой жидкость-жидкостной экстракции.Методы. Содержание силденафила и его десметилированного метаболита определяли в надосадочной жидкости методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием. Ионизацию cилденафила, N-десметил силденафила, cилденафила-d8 и N-десметил силденафила-d8 проводили электрораспылением в положительном режиме (ESI, Positive). При детектировании использовали мониторинг мультиреакций (MRM) выбранных материнских ионов с m/z 475,30; 483,20; 461,20; 469,20. Дочерний ион был выбран с m/z 283,10 для всех анализируемых соединений.Результаты. В ходе валидации данного метода в линейном диапазоне 5,05-1009,92 нг/мл для силденафила и 2,24-400,84 нг/мл для N-десметил силденафила коэффициент корреляции (r2) составил 0,9975 и 0,9973 соответственно, также была продемонстрирована надёжная правильность и воспроизводимость результатов для обеих аналитов.Выводы. Разработан и валидирован простой, специфический и чувствительный ВЭЖХ-МС/МС метод количественного определения концентрации силденафила и его активного метаболита N-десметил силденафила в плазме крови человека с применением меченных стабильными изотопами внутренних стандартов - силденафил-d8 и N-десметил силденафил- d8. Разработанный нами экспресс-метод подготовки биологических образцов, позволяет исключить влияние биологической матрицы на получаемые результаты и определять низкие концентрации обоих аналитов в надосадочной жидкости без применения таких трудоемких и времязатратных процедур, как концентрирование пробы, восстановление сухого остатка или дорогостоящей твердофазной экстракции. Экспериментальные данные, полученные в ходе полной валидации метода, соответствуют установленным национальным и международным требованиям, а так же подтверждают высокую специфичность, чувствительность, точность, воспроизводимость и экономичность разработанного нами метода.
Aim. To assess bioequivalence of sildenafil citrate tablet formulation produced by pharmaceutical company “Microkhim” (Rubezhnoe, Ukraine) it was developed and validated a prompt, specific and quite simple method for quantitative determination of sildenafil and its active metabolite - N-desmethyl sildenafil concentrations in the human blood using deuterium labeled internal standards. Direct liquid-liquid extraction procedure was utilized to extract the analytes from the blood plasma.Methods. Contents of sildenafil and its metabolite in supernatant were determined by means of the high performance liquid chromatography / tandem mass spectrometric detection technique. Ionization of sildenafil, N-desmethyl sildenafil, sildenafil-d8 and N-desmethyl sildenafil-d8 was performed in the positive electrospray mode (ESI, Positive). Detection of the analytes was carried out in the multi reactions monitoring (MRM) regimen with the following m/z values for selected parent ions: 475,30; 483,20; 461,20 and 469,20, respectively. The daughter ion m/z value was selected to be 283,10 for all analytes.Results. Analytical method proposed proved to demonstrate reliable accuracy and reproducibility for both analytes and has been validated within linear range 5,05-1009,92 ng/ml for sildenafil and 2,24-400,84 ng/mL for N-desmethyl sildenafil with correlation coefficient (r2) equaled to 0.9975 and 0.9973, respectively.Conclusions. It was developed and validated a simple, specific and sensitive HPLC-MS/MS method for quantitative determination of sildenafil and its active metabolite N-desmethyl sildenafil concentrations in human blood plasma utilizing stable isotope labeled internal standards – deuterated sildenafil-d8 and N-desmethyl sildenafil- d8. Important feature of the method was a modified preanalytical procedures of biological samples preparation – direct liquid-liquid extraction that allowed to avoid laborious and time-consuming procedures such as evaporation to concentrate the samples with consequent recovery of dry residue, as well as to refuse from expensive solid-phase extraction. Application of the deuterium labeled internal standards allowed to suppress a biological matrix effect drastically, as well as to reach target LLOQ level. Experimental data obtained in the course of full validation of the method proposed that was performed in accordance with approved national and international technical and regulatory requirements, allowed to affirm high specificity, sensitivity, accuracy, reproducibility and efficiency of the method.