Proteindynamik - Flexibilität in Zielproteinen des strukturbasierten Wirkstoffdesigns

In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Methoden des computergestützten strukturbasierten Wirkstoffdesigns in verschiedenen Projekten zur Anwendung gebracht. // Es wurden dabei fünf verschiedenen Zielproteine in drei Targetklassen untersucht. (1) Aus der Superfamilie der Aldo-Keto-Reduktasen wurden zwei Mitglieder der Familie 1 untersucht: Zum einen Aldosereduktase, die auf Grund ihrer Beteiligung an diabetischen Komplikationen im fortgeschrittenen Stadium dieser Erkrankung von Interesse ist, zum anderen das Mitglied AKR1B10 dieser Familie, dessen Überexpression mit verschiedenen Krebsarten assoziiert ist. (2) PRMT4 und PRMT6, die als epigenetische Zielproteine ein aktuelles und zukunftsträchtiges Themengebiet darstellen. (3) Ein bakterielles Target in dieser Arbeit stellte die tRNA-Guanin Transglykosylase (TGT) dar, die auf Grund ihrer initialen Funktion in der Aktivierungskaskade des pathogenen Phänotyps von Shigella flexneri ein interessantes Target für die Behandlung der durch Shigellen ausgelösten Bakterienruhr darstellt. //// Aldosereduktase // Die AR gehört zu der Superfamilie der Aldo-Keto-Reduktasen. Als NAD(P)(H)-abhängige Oxidoreduktase ist sie in erster Linie für die Umwandlung von Glukose zu Sorbitol im Polyolweg bekannt. Darüber hinaus leistet sie durch die Reduktion von giftigen Aldehyden und Carbonylen einen wichtigen Beitrag zur Entgiftung des Organismus. Die Aldosereduktase wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Diederich (Marburg) und GE Healthcare Bio-Sciences AB untersucht. Der Fokus dieses Projekts lag auf der Charakterisierung einer Ligandenserie und Untersuchung des Bindungsverhaltens dieser Liganden in Hinblick auf das Öffnungsverhalten der transienten Spezifitätstasche des Proteins. Der Beitrag dieser Dissertation war die Untersuchung der Proteindynamik im Bezug auf diese Tasche und die Analyse und Beschreibung eines möglichen Öffnungsmechanismus. Die Daten für diese Analysen wurden durch molekulardynamische Simulationen gewonnen. Ein weiterer Beitrag war die Durchführung von MM-GBSA-Berechnungen zur Evaluierung der Bindungspräferenz zweier ähnlicher Liganden in Bezug auf die Spezifitätstasche. // AKR1B10 // In diesem Kooperationsprodukt wurden vergleichende Simulationen eines Liganden (JF0064) durchgeführt, um (1) die röntgenkristallographisch beobachtete Protonierung des Liganden im Komplex mit dem Protein zu validieren und (2) strukturelle Einblicke in die Bindungskonformation des Liganden im Komplex mit dem Wildtyp-Protein zu bieten. Die molekulardynamischen Simulationen boten hier einen Einblick in die Struktur des Wildtyp:JF0064-Komplexes, dessen röntgenkristallographische Aufklärung nicht möglich war. // Protein-Arginin-Methyltransferasen // In diesem Kapitel wurden verschiedene Verfahren verwendet, um zwei Aufgabenstellungen umzusetzen. (1) In Kooperation mit der Arbeitsgruppe Bauer wurde ein Homologiemodell für die Gallus gallus PRMT4 erstellt. Bisher wurde in Vögeln, als einziger Klasse der Wirbeltiere, kein PRMT4-Homolog nachgewiesen. Hannah Berberich gelang erstmalig der Nachweis einer putativen Gallus gallus PRMT4 (ggPRMT4). Der Anteil dieser Dissertation war die Erstellung eines plausiblen in silico Modells der ggPRMT4. Dafür wurden verschiedene in silico Methoden miteinander kombiniert. Im Rahmen dieses Projekts wurde zur Erstellung des ggPRMT4-Modells eine Homologiemodellierung kombiniert mit einem Protein-Protein-Docking durchgeführt. Die Validierung und Untersuchung der Dynamik des modellierten Komplexes erfolgte durch ergänzende molekulardynamische Simulationen. (2) Im Rahmen eines Dockings von organischen Kleinmolekülen wurden die beiden Proteine PRMT4 und PRMT6 – ausgehend von bekannten Kristallstrukturen – als Targets adressiert. Diesen Dockingläufen schloss sich die visuelle Inspektion der durch Scoring-Funktionen vorselektierten Moleküle an. Anschließend wurden interessante Verbindungen kommerziell erworben und in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Bauer von Antje Repenning in einem Assay getestet. Dabei konnten aktive Substanzen gefunden werden, die nun weiter untersucht werden und als Ausgangspunkte für rationales Wirkstoffdesign dienen können. // tRNA-Guanin Transglykosylase // Dieses Target wurde im Rahmen von zwei Studien untersucht. In (1) wurde zunächst die Dynamik einer bei röntgenkristallographischen Untersuchungen neu entdeckten Subtasche unter der beta1alpha1-Schleife untersucht. Dabei erfolgte die Untersuchung erst mit Hilfe molekulardynamischer Simulationen. Im zweiten Schritt wurde diese Tasche dann in einem Docking mit organischen Molekülen adressiert. In (2) wurde das Öffnungsereignis der transienten erweiterten Guanin/preQ1-Bindetasche durch molekulardynamische Simulationen analysiert.
In this thesis different methods of computer-aided drug design have been applied to diverse problems in several projects. // Five different target proteins from three distinct target classes have been investigated. (1) From the super family of aldo-keto reductases, two members of the subfamily 1 have been examined. Firstly, aldose reductase which is of special interest due to its role during complications in advanced states of diabetes. Secondly, another member of the same family: AKR1B10 which is associated with various cancers. (2) Protein arginine methyltransferase 4 (PRMT4) and PRMT6 that represent an up-to-date and seminal topic due to their epigenetic function. (3) A bacterial target represented by tRNA-guanin transglycosylase (TGT). This protein fulfills an initial function in the activation cascade of the pathogenic phenotype of Shigella flexneri and, therefore, serves as an interesting target for the treatment of shigella induced bacillary dysentery. //// Aldose reductase // AR belongs to the super family of aldo-keto reductases. It is a NAD(P)(H) dependent oxidoreductase and, hence, mostly known for the conversion of glucose to sorbitol in the polyol pathway. Furthermore, it contributes to the detoxification of the organism by reducing toxic aldehydes and carbonyls. The Investigations on aldose reductase were conducted in cooperation with the Diederich group (Marburg) and GE Healthcare Bio-Sciences AB. The project was focused on characterizing a ligand series and examining the binding properties of these ligands with regard to opening events of a transient specificity pocket in this protein. This thesis contributed to this via an investigation of protein dynamics related to the pocket and an analysis and description of possible opening mechanisms. The necessary data for the analysis was obtained by conducting molecular dynamics simulations. Furthermore, MM-GBSA calculations were performed to evaluate binding preferences of two similar ligands to the specificity pocket. // AKR1B10 // In this cooperation project, comparative simulations of a ligand (JF0064) were executed to achieve two goals. (1) Validate the protonation state of the ligand in complex with the protein that has been observed in the x-ray structure. (2) Gaining structural insights on the binding conformation of the ligand to the wildtype protein. Since structure determination of the wildtype:JF0064 complex with x-ray crystallography was not possible, these molecular dynamic simulations allowed us to gain an insight on its structure. // Protein arginine methyltransferases // In this project several methods were used to accomplish two different tasks. (1) In cooperation with the Bauer group an homology model of Gallus gallus PRMT4 was built. To date, birds were the only class of vertebrates without experimental proof for an PRMT4 homologue. Hannah Berberich succeeded as the first to prove the existence of putative Gallus gallus PRMT4 (ggPRMT4). This thesis contributed by generating a feasible in silico model of ggPRMT4. Several in silico methods have been used in combination to accomplish this goal. To generate the ggPRMT4 model, homology modeling was combined with protein-protein docking. Furthermore, molecular dynamics simulations were used to validate the model and analyze the dynamics of the modeled complex further. (2) PRMT4 and PRMT6 were addressed as targets in a docking study using small organic molecules and known crystal structures of both proteins. All dockings were further evaluated by visual inspection subsequent to pre-selecting the molecules with a scoring function. Afterwards, interesting compounds were purchased and in cooperation with the BAUER group tested in a biological assay by Antje Repenning. As a result of this process, active compounds were identified. These compounds will now be further characterized and may be used as a starting point for rational drug development. // tRNA-guanin transglycosylase // This target was analyzed in two studies. (1) The dynamics of a, by x-ray crystallographic methods newly discovered, sub-pocket underneath the beta1alpha1-loop were analyzed. Therefore, firstly the pocket was examined via molecular dynamics methods. In a second step, the pocket was addressed by docking with organic molecules. (2) The opening event of the transient extended guanin/preQ1 binding pocket was analyzed with molecular dynamics simulations.