Avaliação das atividades farmacológicas de uma serinoprotease, isolada a partir do veneno total de Brothrops barnetti

Orientadores: Sergio Marangoni, Luis Alberto Ponce Soto Dissertação ( mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Os venenos de serpentes contêm uma variedade de proteínas que são estudadas no mundo pela importância biológica e farmacológica. Dentro de sua complexa composição, o veneno apresenta enzimas proteases, como as metaloproteases e serinoproteases que estão envolvidas em distúrbios hemostáticos e coagulantes, interferindo na agregação plaquetária. O presente trabalho teve como objetivo purificar, caracterizar bioquimicamente e avaliar as atividades farmacológicas de uma serinoprotease com atividade coagulante, do veneno de Bothrops barnetti nomeada TLBbar. A purificação envolveu dois passos cromatográficos, exclusão molecular em Sephadex G-75 e HPLC de fase reversa em coluna analítica Supelco C8, obtendo-se um alto grau de pureza e homogeneidade, revelado com SDSPAGE e com Mr ~ 28,5 kDa. TLBbar mostrou homlogia sequêncial com outras serinoproteases de veneno de serpentes, evidenciado através de espectrometria de massas MS/MS, como a trombina-like denominada Calobin, isolada e caracterizada a partir de Agkistrodon caliginosus (Korean Viper), Crotalase (Crotalus adamanteus), flavoxobin (Trimeresurus flavoviridis) entre outras. Observa-se na homologia que as serinoproteases, com as quais foi comparada a TLBbar, apresentam os aminoácidos conservados do sítio catalítico (His57, Asp102, Ser195), já na sequencia da TLBbar demonstra-se a presença do aminoácido histidina na posição 57 da tríada catalítica. Este resultado em conjunto com as atividades enzimáticas e biológicas, confirmam que TLBbar pertence ao grupo de enzimas serinoproteases com atividade trombina-like. A enzima apresenta sua maior atividade proteolítica a 37oC e em pH 8, sendo essa alterada na presença de íons divalentes por interações eletrostáticas entre enzima e substrato. TLBbar apresenta um comportamento michaeliano segundo os estudos cinéticos realizados com o substrato BApNA, revelando um Vmax e Km de 0,42nmol/min e 0,433mM, respectivamente. Em presença de heparina mantem 80% de sua atividade, e apresenta relativa estabilidade frente a SBT-I e agentes quelantes como EDTA e EGTA. TLBbar tem atividade coagulante sobre fibrinogênio bovino (atividade fibrigenolítica), formando um coágulo semi-rígido, pois não ativa o fator XIII da cascata de coagulação como faz a trombina que resulta na formação de um coágulo consistente. Sua atividade fibrigenolítica foi evidenciada pela liberação dos fibrinopeptídios A, pela degradação da cadeia A? do fibrinogênio, a qual foi inibida por PMSF e Leupeptina, confirmando sua classificação no grupo das serinoproteases. A eficiência desta atividade fibrigenolítica foi observada entre 30 oC e 40oC durante 2 horas de incubação e alterada em presença de íons divalentes como cálcio, magnésio e bário, ressaltando a maior atividade fibrigenolítica com o cálcio. A enzima purificada TLBbar foi capaz de agregar plaquetas e em concentração de 2,5?g evidenciou comportamento semelhante à trombina. Interessante que TLBbar estimula a agregação plaquetária assim como também retarda dita atividade no tempo quando comparado com o controle (trombina). Este fato é devido a sua mudança de conformação estrutural que corresponde à ativação plaquetaria a qual ocorre com mais lentidão (nos primeiros minutos), em comparação a transformação causada pela trombina, tendo como conseqüência a liberação mais lenta de agentes como ADP e tromboxanos A2, necessários para alcançar a adesão plaquetária. A serinoprotease TLBbar não apresenta toxicidade, pois não possui atividades edematogênica, hemorrágica e miotóxica in vivo. Por outro lado, TLBbar evidencia capacidade de dissolver o coágulo de fibrina gerado pela trombina após 36 horas de incubação a 37oC, esta atividade foi inibida com PMSF nas mesmas condições, estes dados sugerem a presença de atividade fibrinolítica Abstract: The snake venoms contain variety of proteins and are studied in the world for biological and pharmacological importance, within their complex composition of the venom protease enzymes present, as metalloproteases and serineproteases that cause hemostatic disorders, coagulantes and platelet aggregation. The present dissertation aimed to purify, biochemically characterize and evaluate the pharmacological activities of a serine protease with coagulant activity named TLBbar from Bothrops barnetti. Its purification involved two chromatographic steps, molecular exclusion in Sephadex G-75 and reversedphase HPLC with a Supelco C8 analytical column, obtaining high purity and homogeneity revealed by SDS-PAGE with Mr ~ 28.5 kDa. The enzyme has its highest proteolytic activity at 37 °C and at pH 8, which is altered in the presence of divalent ions by electrostatic interactions between enzyme and substrate. TLBbar presents a Michaelis-Menten behavior according the kinetic studies revealing a Km and Vmax of 0.433 mM and 0.42 nmol/min, respectively. TLBbar in the presence of heparin maintains its activity around 80%, although has relative stability compared with SBT-I and chelating agents such as EDTA and EGTA. TLBbar has coagulant activity on bovine fibrinogen, forming a clot semi-rigid, different the action of thrombin that results in the formation of a clot consistent. Its fibrigenolytic activity was evidenced by the release of fibrinopeptides A, by degradation of fibrinogen A? chain, which was inhibited by PMSF and Leupeptin, confirming its classification in the group of serineproteases. The efficiency of this activity was observed between 30 and 40 °C during 2 hours of incubation and changed in the presence of divalents ions such as calcium, magnesium and barium, brings out the greatest fibrigenolytic activity with calcium. The purified enzyme TLBbar was capable of aggregating platelets; 2.5?g of concentration evidence similar behavior to thrombin, TLBbar interesting stimulates platelet aggregation as well as delay time in such activity when compared with control (thrombin). We suggest that structural process of platelet activation occurs over a longer period of time with TLBbar as a result of release of ADP and thromboxane A2 agents that happen that occur with less speed to achieve platelet adhesion compared with thrombin. This enzyme not showed edematogenic-activity when compared with the activity caused by B. Barnetti snake venom, did not induce hemorrhagic nor myotoxic effect in vivo. On the other hand, TLBbar had proteolytic activity similar to thrombin, proven in the fibrigenolytic activity on bovine fibrinogen as measured in the release of fibrinopeptides in times of release similar to the control, the proteolytic activity was also evidenced by the ability to dissolve fibrin clot generated by Thrombin after 36 hours of incubation at 37 °C, the activity was inhibited with PMSF under the same conditions, these data suggest the presence of fibrinolytic activity Mestrado Bioquímica Mestre em Biologia Funcional e Molecular