Cell biological analysis of ER-to-cytosol retrotranslocation of a cytotoxic alpha-variant of the viral A/B toxin K28 in yeast

Das virale A/B-Toxin K28 aus Saccharomyces cerevisiae tötet sensitive Hefen in einem rezeptorvermittelten Prozess durch Induktion eines Zellzyklusarrestes. Nach endozytotischer Internalisierung durchläuft das Toxin den Sekretionsweg retrograd über Golgi und ER. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der ER/Cytosol-Retrotranslokation von K28 im Detail untersucht. Durch die Expression einer letalen K28alpha-Variante im ER-Lumen ausgewählter Deletionsmutanten konnte nachgewiesen werden, dass K28alpha nach Eintritt in den Sekretionsweg mit Hilfe von Erv29p und Bst1p in COPII-Vesikel verpackt und zum Golgi transportiert wird, wo die pro-Region durch die Aktivität der Endoprotease Kex2p entfernt wird. Dieser Schritt ist zwingend notwendig für die in vivo Toxizität von alpha. Im Gegensatz zu exogen appliziertem A/B-Toxin nutzt K28alpha den zellulären ERAD-Qualitätskontrollmechanismus, um aus dem ER in das Cytosol zu gelangen. Es konnte gezeigt werden, dass die Funktion des HRD1-Komplexes (im Unterschied zu CDC48) von essenzieller Bedeutung für die Toxizität von alpha ist. Wurde eine Polyubiquitinierung von K28alpha durch Austausch der internen Lysinreste verhindert oder eine Ubiquitinmutante, die keine Polyubiquitinketten mehr bilden kann, simultan überexprimiert, so kam es in beiden Fällen zu einem Verlust der Toxizität. Die Ubiquitinierung von K28alpha scheint somit für die Toxin-Retrotranslokation wichtig zu sein; ein direkter biochemischer Nachweis hierfür konnte bislang jedoch noch nicht erbracht werden. K28, a viral A/B toxin produced by killer strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae, kills sensitive yeasts in a receptor mediated process by inducing a cell cycle arrest. After endocytotic uptake the toxin passes the secretory pathway in reverse via Golgi and ER. In this study, toxin retrotranslocation from the ER into the cytosol has been investigated in detail by regulated expression of a lethal K28alpha variant in the ER of selected deletion mutants. By this means it became evident that K28alpha is packaged into COPII vesicles and transported to the Golgi by the help of Erv29p and Bst1p which normally recruit lumenal ERAD substrates. Within a late Golgi removal of the pro-region by endopeptidase Kex2p cleavage is crucial for the in vivo toxicity of K28alpha. In contrast to exogenously applied A/B toxin, K28alpha reaches the cytosol by abusing components of the ER quality control pathway ERAD. Sensitivity assays further indicated that HRD1 (in contrast to CDC48) complex components play a central role in K28alpha in vivo toxicity. Preventing polyubiquitination of K28alpha either by substitution of all internal lysine residues or by simultaneous overexpression of mutant ubiquitin, unable to form polyubiquitin chains, severely impaired in vivo toxicity. Thus, ubiquitination of K28alpha seems to be essential for its retrotranslocation, although a direct biochemical proof is still missing.