Zur Rolle von luminalen Proteinen und Membranproteinen des endoplasmatischen Retikulums bei der Biogenese sekretorischer Proteine

Der Transport in das endoplasmatische Retikulum (ER) ist der erste Schritt in der Biogenese sekretorischer Proteine. Im Säuger erfolgt der Transport hauptsächlich cotranslational, was eine enge Kooperation zwischen Ribosom, Translokon an der ER-Membran und luminalen Proteinen erfordert. Die Hauptkomponente des Translokons ist der Sec61-Komplex, der die Translokationspore bildet. Weitere Komponenten, Sec62p und Sec63p, wurden identifiziert. Diese Proteine (a) kommen in äquimolaren Konzentrationen mit Sec61a (Untereinheit des Sec61-Komplexes) vor (b) interagieren miteinander und mit dem Sec61-Komplex und (c) seine Ho-mologe in der Hefe sind für den posttranslationalen Transport und Sec63p auch für den cotranslationalen Transport essentiell. Dies deutet darauf hin, dass Sec62p und Sec63p des Säugers am cotranslationalen Transport beteiligt sind. Eine Sequenzanalyse von Sec62p zeigt die Anwesenheit eines im Hefeprotein nicht konservierten basischen Peptidmotives, das charakteristisch für ribosominteragierende Proteine ist. In der vorliegenden Arbeit wurden Fragmente des Säuger-Sec62p in E. coli synthetisiert und es wurde durch klassische Ribosomenbindungs- und Fraktionierungstudien gezeigt, dass Sec62p durch seine N-terminale cytosolische Domäne direkt mit Ribosomen interagiert. Hierbei handelt es sich um eine bei physiologischer Salzkonzentration stabile elektrostatische Interaktion, wofür das basische Motiv wichtig ist. Mittels Kompetitionsanalysen für die Bindung an Ribosomen wurde gezeigt, dass die Bindungsstelle von Sec62p mit dem Bereich des Ribosoms, das für die Interaktion mit dem Translokon verantworlich ist, überlappt, und dass diese Bindungsstelle auch von dem Hsp40-Chaperon Mtj1p/ERj1p verwendet wird. Die funktionelle Bedeutung der Sec62p-Ribosom-Interaktion wurde in einem zellfreien in vitro-Translationssystem untersucht. Sec62p wirkt inhibitorisch auf die Proteinsynthese von sekretorischen und nicht-sekretorischen Proteinen. Hierbei handelt es sich um eine Hemmung der Initiation der Translation. Die Interaktion von Sec62p am ribosomalen Tunnelausgang bewirkt Veränderungen in der Translationsfaktorenbindungstelle des Ribosoms, was auf einen allosterischen Wirkungsmechanismus für die Induktion der Translationshemmung hindeutet. Der Einfluss von Sec62p auf die Proteinsynthese bei Translokationsvorgängen wird diskutiert und anhand der Analogien mit Mtj1p wird eine Regulation von Sec62p über seine Interaktion mit Sec63p vorgeschlagen. Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten unterstützen ein Modell, bei dem Sec62p durch die Interaktion mit Ribosomen und wahrscheinlich auch durch Interaktion mit Sec63p einen Informationsaustausch zwischen dem Cytosol und dem Lumen des endoplasmatischen Retikulums vermittelt. Das luminale Hsp70-Chaperon BiP ist an mehreren Stadien des cotranslationalen Proteintransports beteiligt. Für späte Schritte der Translokation wurde beobachtet, dass BiP durch seine Interaktion mit dem zu transportierenden Substrat die Translokationseffizienz erhöht. Es wurde vorgeschlagen, dass in Analogie zum Hefe-System BiP die naszierende Kette während ihrer Translokati-on bindet und dadurch die Unidirektionalität des Transports zum Lumen gewährleistet. Bei der cotranslationalen Translokation in Vesikeln, die keine luminalen Proteine enthalten, können bereits luminal modifizierte Translokationssubstrate zurück ins Cytosol gelangen. Daher besteht die Möglichkeit, dass die Interaktion von BiP mit dem Substrat tatsächlich erst nach dem vollständigen Transport des Substrats erfolgt, um dieses im ER-Lumen zu halten. In der vorliegenden Arbeit wurde der cotranslationale Transport in einem in vitro-System mit Proteoliposomen rekonstituiert, wobei das Protein Avidin als artifizielles luminales Protein anstelle von BiP und biotinylierte Substrate eingesetzt wurden. Die gewonnenen Daten zeigen, dass die Bindung des Substrats, die zur Erhöhung der Transporteffizienz führt, sowohl während als auch nach seiner Translokation erfolgt. Dies bestätigt die bisher vermutete Funktion von BiP, die Unidirektionalität des cotranslationalen Transports zu sichern, und zeigt darüber hinaus eine erweiterte Funktion von BiP bei der Retention von bereits translozierten Substraten im Lumen des ER. Diese Erkenntnise bringen neue Aspekte im Zusammenhang mit der Termination der Translokation, die in einem Modell dargestellt werden. The transport into the endoplasmic reticulum (ER) is the first step in the biogenesis of secretory proteins. In mammalian cells this transport occurs mainly cotranslationally and requires a tight cooperation between the ribosome, the translocon at the ER-membrane, and luminal proteins. The Sec61-complex that builds the translocation pore is the main component of the translocon. Further components, namely Sec62p and Sec63p, have been identified. These proteins a) are present in equimolar concentrations with the Sec61a subunit of the Sec61-complex, b) interact with each other and with the Sec61-complex and c) in yeast are essential for the posttranslational transport (Sec63p for the cotranslational transport as well). This suggests that mammalian Sec62p and Sec63p are involved in cotranslational protein transport. The sequence analysis of Sec62p reveals the presence of a basic peptide motif which is not conserved in the yeast homolog and that is characteristic of ribosome interacting proteins. In the present work, fragments of the mammalian Sec62p were synthesized in E. coli and analyzed in classical ribosome binding assays. It was shown that Sec62p interacts directly with ribosomes through its N-terminal domain. This interaction is an electrostatic and at physiological salt concentrations stable one, for which the basic motif in Sec62p is important. Through competition analysis for the binding to ribosomes it was shown, that the binding site of Sec62p at the ribosome is overlapping with the binding site of the translocon and of the Hsp40-chaperone Mtj1p/ERj1p. The functional significance of the Sec62p-ribosome interaction was analyzed in a cell-free in vitro-translation system. Sec62p inhibits the protein synthesis of secretory and non-secretory proteins. To do this, Sec62p acts at the level of translation initiation. The interaction of Sec62p with the ribosomal tunnel causes changes in the ribosomal binding site for the translation factors. This points to an allosteric mechanism by which Sec62p induces the inhibition of translation. The influence of Sec62p on protein synthesis is discussed and in analogy to Mtj1p a regulation of Sec62p through its interaction with Sec63p is proposed. The data that have been obtained in this work support a model in which Sec62p mediates an information exchange between the cytosol and the lumen of the endoplasmic reticulum through its interaction with ribosomes and probably Sec63p. The luminal Hsp70-chaperone BiP participates in several stages of cotranslational protein transport. For late steps of translocation it was shown, that BiP increases the translocation efficiency through its interaction with the transport-substrate. It was suggested that, in analogy to the yeast system, BiP binds to the nascent chain during its translocation and determines the unidirectionality of the transport into the lumen. However, studying the cotranslational translocation into vesicles lacking luminal proteins, it was shown, that luminally modified transport-substrates can get back into the cytosol. Thus, there is the possibility that BiP actually interacts with the substrate not during but after its transport to retain it in the ER-lumen. In the present work the cotranslational transport was reconstituted in an in vitro-system with proteoliposomes where biotinylated substrates and the protein avidin, as an artificial luminal protein instead of BiP, were used. The results of this analysis show that the binding of the transport-substrates leads to an increase in transport-efficiency and occurs both during and after translocation of the substrates. This confirms the so far assumed function of BiP in ensuring the unidirectionality of the transport and, additionally, gives evidence of a more extensive function of BiP in the retention of already translocated substrates in the lumen of the endoplasmic reticulum.