Modes of action of cryptochrome 2 from Arabidopsis thaliana

Cryptochromes are photolyase-like blue/UV-A light receptors that regulate various light developmental responses in plants. Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (Atcry2) is the major photoreceptor mediating blue light regulation of flowering induction. Although the biological role of crys in plants is well-known, the initial photochemistry underlying cryptochrome activation and regulation remain poorly understood. In the present work we addressed several aspects in the early activation events of cry 2. Many members of the photoreceptor families and components of the light signalling transduction pathway dimerize. Therefore, we studied wheter Atcry2 dimerizes, too. Immunoprecipitation studies of transgenic Arabidopsis extracts expressing both, cry2-GFP and cry2 revealed that full-lenght Atcry2 is a homodimer in vivo in a light-independent fashion. The identity of the domains involved in cry2 homodimerization were investigated, and both CNT2 and CCT2 were found as monomers. Because of the sequence similarity of cry2 with cry1, heterodimerization between cry1 and cry2 was also studied, but no cry1-cry2 heterodimers were found in our experiments. The in vivo effect of dimerization was investigated using Arabidopsis transgenic lines expression either CCT2-GFP or cry2-GFP in addition of the endogenous cry2. Cry2-GFP dimers showed phosphorylation and degradation under blue light in the same way as the endogenous cry2, whereas under the same conditions the CCT2-GFP monomers remained stable and unphosphorylated. Moreover, cry2-GFP was able to promote early flowering in plants kept under short day conditions. Whereas under the same conditions CCT2-GFP expressing transgenic Arabidopsis flowered as late as wild-type. Crys purified from Escherichia coli contain two chromophores, which were identified as flavin adenine dinucleotide (FAD) and methenyltetrahydrofolate (MTHF), whereas the presence of MTHF was not found for Atcrys purified from an eukaryotic source as insect cells. The detailed knowledge of which chromophore(s) are attached under natural conditions is important for the interpretation of spectroscopic data of these receptors. Therefore, we overexpressed epitope-tagged cry2 in planta. Specific immuno-precipitation of the tagged cry2 protein allowed purification of sufficient amounts of the photoreceptor to identify its chromophores. Based on fluorescence emission data we found that cry2 binds indeed FAD and MTHF in planta. In addition, energy transfer from MTHF to FAD was observed. Because of their similarity in aminoacid sequence and structure, photolyases have been taken as a model for crys photocycle. However, crys were shown to undergo a photocycle in which semireduced flavin (FADHo) accumulates upon blue light irradiation in contrast to photolyase that accumulates fully reduced FADH-. Green light irradiation of cry2 causes a change in the equilibrium of flavin oxidation states, and attenuates cry2-controlled responses such as flowering. Here, we provided in vivo evidence for semireduced flavin (FADHo) being the active FAD redox state in Atcry2 by analysis of the expression of flowering genes, linking in vitro with physiological studies. In order to address further insight into the role of phosphorylation on Atcry2 activity, cry2 protein purification from the plant source following mass spectroscopy was performed. Pitifully, the obtained amounts were too small to allow clear results. Genes that are specifically blue-light induced in cell cultures were identified by PCR and qRT-PCR that can be used in future studies as reporters for transient studies monitoring cry activity.
Cryptochrome sind mit DNA-Photolyasen eng verwandte UV-A/Blaulicht-Photorezeptoren, die zahlreiche Entwicklungsprozesse in Pflanzen steuern. Arabidopsis thaliana Cryptochrom 2 (cry2) spielt hierbei eine zentrale Rolle bei der photoperiodischen Regulation der Blühinduktion. Obwohl die biologischen Funktionen von Cryptochromen in Pflanzen gut untersucht sind, sind deren photochemischen Prozesse, die zur Aktivierung führen, wenig verstanden. In der vorliegenden Arbeit wurden zahlreiche Aspekte der Aktivierung von cry2 untersucht. Zahlreiche pflanzlichen Photorezeptoren und Komponenten der Lichtsignaltransduktion dimerisieren. Entsprechend wurde hier untersucht, ob dies auch für cry2 der Fall ist. Immunpräzipitationsstudien an Proteinextrakten transgener Arabidopsis Pflanzen, die cry2-GFP exprimieren, zeigten, dass cry2 in vivo als Dimer vorliegt. Licht scheint keinen Einfluss auf die Dimerisierung zu haben. Bei der Analyse, welche Domänen von cry2 für Dimerisierung notwendig sind, konnten keine eindeutigen Befunde erzielt werden, da sowohl die N-terminale Domäne (CNT2) als auch die C-terminale Domäne (CCT2) als Monomer gefunden wurden. Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit von cry2 mit cry1 wurde untersucht, ob diese Heterodimere bilden. Die vorliegenden Befunde gaben darauf keinen Hinweis. Um die Rolle der Dimerisierung von cry2 auf dessen biologische Funktion zu untersuchen, wurden transgene Linien untersucht, die neben dem endogenen cry2 zusätzlich CCT2-GFP oder cry2-GFP exprimieren. Cry2-GFP Dimere wurden lichtabhängig phosphoryliert und abgebaut, ähnlich dem endogenen cry2. Im Gegensatz hierzu, blieben die CCT2-GFP Monomere unphosphoryliert und stabil. Weiterhin führte die Expression von cry2-GFP zu einer Beschleunigung des Blühens unter Kurztag-Bedingungen im Vergleich zum Wildtyp, nicht aber die Expression von CCT2-GFP. Pflanzliche Cryptochrome, die in E. coli exprimiert wurden, tragen zwei Chromophore (FAD und MTHF). Nach Expression in eukaryontischen Systemen wie Insektenzellen konnte bislang allerdings keine Bindung von MTHF an cry nachgewiesen werden. Kenntnisse darüber, welche Chromophore an cry in planta gebunden sind, sind für die Interpretation der spektroskopischen Daten dieser Photorezeptoren bedeutsam. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit Epitop-markiertes cry2 in Pflanzen exprimiert und spezifisch über Immunpräzipitation in Mengen aufgereinigt, die eine Identifizierung der gebundenen Chromophore ermöglichte. Die Ergebnisse von Fluoreszenz-Emissionsspektroskopie zeigten, dass cry2 in planta sehr wahrscheinlich beide Cofaktoren, FAD und MTHF, bindet. Zusätzlich ergaben diese Untersuchungen Hinweis auf Energietransfer von MTHF auf FAD. Augrund der Ähnlichkeit von Photolyasen und Cryptochromem in ihrer Aminosäuresequenz and Struktur wurde die Photochemie von Photolyasen als Modell für den Photozyklus von Cryptochromen benutzt. Allerdings zeigten in vitro Untersuchungen, dass Cryptochrome nach Anregung mit Blaulicht semireduziertes Flavin (FADHo) akkumulieren, im Gegensatz zu Photolyasen, die vollständig reduziertes Flavin (FADH-) bilden. Zu Blaulicht zusätzlich gegebenes Grünlicht verschiebt das Gleichgewicht der Oxidationszustände von Flavin hin zu oxidiertem FAD und reprimiert cry2-kontrollierte Prozesse wie die Induktion der Blütenbildung. Hier durchgeführte Untersuchungen über die Wirkung von Grünlicht auf die Expression von Blühgenen lieferten zusätzliche Hinweise darauf, dass cry2 mit semireduziertem Flavin den aktiven Zustand dieses Photorezeptors repräsentiert. Zum weiteren Verständnis der Phosphorylierung von cry2 wurde versucht, das Protein aus Pflanzen in Mengen zu isolieren, die für nachfolgende massenspektrometrische Analysen ausreichend sind. Leider wurde dieses Ziel nicht erreicht. Weiterhin wurden die Expression zahlreicher Gene in Arabidopsis Zellkulturen durch PCR- und quantitative real-time PCR-Analysen daraufhin untersucht, ob sie spezifisch durch Blaulicht reguliert werden. Einige Gene konnten hierbei identifiziert werden, die in zukünftigen Untersuchungen als Reporter genutzt werden können, um die Aktivität von Wildtyp und Mutanten Cryptochromen zu untersuchen.