Molekularbiologische und biochemische Untersuchungen zu Prenyltransferasen aus Stigmatella aurantiaca und Aspergillus fumigatus

Prenylated compounds are widely distributed in all living organisms and often posses biological activities differing from their non-prenylated precursors. Transfer reactions of an isoprene moiety from a prenyl donor onto an acceptor molecule, e. g. a terpenoid, a serine residue of a protein or an aromatic molecule, are catalyzed by prenyltransferases. Aromatic prenyltransferases are responsible for prenylation of aromatic compounds and found as membrane-bound or soluble enzymes in bacteria, fungi and plants. They contribute to the diversity of primary and secondary metabolites. During the last decades, many prenylated natural products were isolated from different microorganisms. These natural products include aurachins, a group of quinoline alkaloids from myxobacteria. In this thesis the gene auaA from the putative biosynthetic gene cluster of aurachins in the myxobacterium Stigmatella aurantiaca Sg a15 was heterologously expressed in E. coli and the gene product was subsequently characterized biochemically. AuaA was unequivocally demonstrated to function as a farnesyltransferase catalyzing the prenylation of 2-methyl-4-hydroxyquinoline at position C3 of the quinoline ring. The enzymatic reaction of AuaA followed apparently Michaelis-Menten-kinetics and was strictly dependent on the presence of divalent metal ions. KM-values were determined for 2-methyl-4-hydroxyquinoline and FPP at 0.27 mM and 0.043 mM, respectively. The maximum reaction velocity Vmax was determined at 2.21 nmol/min*mg. Like other aromatic prenyltransferases AuaA showed also flexibility towards aromatic substrates. In addition to its natural substrate 2-methyl-4 hydroxyquinoline, this membrane-bound enzyme accepted also six other 4-hydroxyquinolines and low conversion was even observed for two of six tested flavonoids. In contrast to the promiscuity towards aromatic substrates, AuaA was found to be relatively specific for FPP. GPP was accepted only with a relative activity of 3.3 % in comparison to FPP. Selected amino acid residues in the aspartate-rich motifs, which are characteristic for membrane-bound aromatic prenyltransferases, were investigated in AuaA by site-directed mutagenesis. By mutation of the conserved aspartate residues, the importance of these residues was confirmed. Mutation of the arginine residue in the first aspartate-rich motif (NRxxDxxxD) revealed that the amino acid at this position is not directly involved in the AuaA reaction, which is in contrast to the results obtained for LePGT1, another prenyltransferase from this group. The enzymes FgaPT2, FtmPT1 und 7-DMATS from Aspergillus fumigatus belong to aromatic prenyltransferases of the DMATS-family and catalyze the transfer of a prenyl moiety onto an indole ring. In contrast to membrane-bound aromatic prenyltransferases, they do not contain aspartate-rich motifs for binding of prenyl diphosphate via divalent metal ions and their activities are independent of the presence of metal ions. Therefore it was speculated that basic amino acid residues in prenyltransferases of the DMATS-family coordinate the prenyl diphosphate residue. To investigate the importance of three conserved basic amino acid residues for the catalytic activites, site-directed mutagenesis experiments were carried out with FgaPT2, FtmPT1 and 7-DMATS. The results indicated that two lysine residues are involved in the prenyl transfer catalyzed by these enzymes. Mutation of arginine, the third chosen amino acid residue, led only in FgaPT2 to a strong decrease of enzyme activity, indicating that the corresponding arginine residues in FtmPT1 and 7-DMATS are not directly involved in the prenylation reactions. After solution of the crystal structure of FgaPT2 and analyzes of the enzyme complex with L-tryptophan and DMASPP, a substrate analogue to dimethylallyl diphosphate (DMAPP), a reaction mechanism was postulated. In this mechanism the amino acid residues E89, R100 and K174 should play essential roles. In order to verify this hypothesis, mutagenesis experiments of the suggested residues were carried out and the effects of the mutations on the enzyme activity were determined. Mutation of E89 and R100 confirmed the essential roles of these residues for the catalysis of FgaPT2. In contrast, substitution of K174 by glutamine did not support the importance of this residue for the postulated reaction mechanism.
Prenylierte Naturstoffe sind in allen lebenden Organismen weit verbreitet und weisen häufig biologische Aktivitäten auf, die sich oft von ihren nicht prenylierten Vorstufen unterscheiden. Transferreaktionen von Isopreneinheiten von einem Prenyldonor auf ein Akzeptormolekül, wie z.B. ein Terpenoid, ein Serinrest oder einen Aromaten, werden von Prenyltransferasen katalysiert. Für die letzte Reaktion sind die sogenannten aromatischen Prenyltransferasen verantwortlich, die als membrangebundene oder lösliche Enzyme in Pflanzen, Pilzen und Bakterien auftreten und zu einer großen Vielfalt an Primär- und Sekundärmetaboliten beitragen. Im Laufe der letzten Jahrzehnte sind viele prenylierte Substanzen mit interessanten biologischen Aktivitäten aus Mikroorganismen isoliert worden, deren Biosynthese großteils noch unbekannt war. Zu diesen Naturstoffen gehörten unter anderem die Aurachine, eine Gruppe von Chinolinalkaloiden aus Myxobakterien. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnte das Gen auaA aus dem putativen Gencluster für Aurachinbiosynthese in dem Myxobakterium Stigmatella aurantiaca Sg a15 heterolog in E. coli exprimiert und das Genprodukt anschließend biochemisch charakterisiert werden. Dabei wurde eindeutig gezeigt, dass AuaA als eine Farnesyltransferase fungiert und die Bildung von Aurachin D durch Prenylierung von 2-Methyl-4-Hydroxychinolin an Position C3 des Chinolinrings katalysiert. Die enzymatische Reaktion folgte der Michaelis-Menten-Kinetik und war strikt abhängig von divalenten Metallionen. Die KM-Werte für 2-Methyl-4-Hydroxychinolin und FPP betrugen 0.27 mM und 0.043 mM und die maximale Reaktionsgeschwindigkeit 2.21 nmol/min*mg. AuaA zeigte Flexibilität gegenüber aromatischen Substraten, da es neben dem natürlichen Substrat auch sechs weitere 4 Hydroxychinoline akzeptierte und sogar zwei von sechs getesteten Flavonoiden in geringem Maße umsetzte. Im Gegensatz dazu war das Enzym relativ spezifisch in Bezug auf den Prenyldonor. Neben FPP akzeptierte AuaA zwar GPP, jedoch nur mit einer relativen Aktivität von 3.3 %. Mittels zielgerichteter Mutagenese wurden ausgewählte Aminosäurereste in den für membrangebundene aromatische Prenyltransferasen charakteristischen aspartatreichen Motiven in AuaA untersucht. Durch die Mutationen konnte die essentielle Bedeutung der konservierten Asparaginsäurereste bestätigt werden. Die Mutation des Arginins im ersten aspartatreichen Motiv (NRxxDxxxD) zeigte, dass die Aminosäure an zweiter Position in dem Motiv nicht direkt in die von AuaA katalysierte Reaktion involviert ist, was einen Unterschied zu LePGT1, einer weiteren Prenyltransferase dieser Enzymgruppe, darstellt. Die Enzyme FgaPT2, FtmPT1 und 7-DMATS aus Aspergillus fumigatus gehören zu aromatischen Prenyltransferasen der DMATS-Familie und katalysieren den Transfer eines Prenylrests auf einen Indolkörper. Anders als membrangebundene aromatische Prenyltransferasen enthalten sie keine konservierten aspartatreichen Motive zur Bindung des Prenyldiphosphates durch divalente Metallionen und ihre Aktivität ist ionenunabhängig. Diese Tatsache führte zu der Vermutung, dass in den Prenyltransferasen der DMATS-Familie basische Aminosäuren die Rolle der Metallionen bei der Koordination von Prenyldiphosphat übernehmen könnten. Mit Hilfe von zielgerichteter Mutagenese wurde die Bedeutung von drei konservierten basischen Aminosäureresten für die katalytische Aktivität der Prenyltransferasen FgaPT2, FtmPT1 und 7-DMATS untersucht. Die Experimente zeigten, dass zwei Lysinreste in die von allen drei Enzymen katalysierten Prenylierungsreaktionen involviert sind, während die Mutation des ausgewählten Argininrests nur in FgaPT2 zu einem deutlichen Aktivitätsverlust führte. Dies deutete darauf hin, dass dieser Argininrest in FtmPT1 und 7-DMATS nicht direkt an der Prenylierung beteiligt ist. Durch Aufklärung der Struktur von FgaPT2 und Analysen des Enzymkomplexes mit L-Tryptophan und DMASPP, dem Substratanalogon von Dimethylallyldiphosphat (DMAPP), konnte ein Prenylierungsmechanismus postuliert werden, bei dem die Aminosäurereste E89, R100 und K174 eine essentielle Rolle spielen sollten. Zur Überprüfung der Hypothese wurden diese Aminosäurereste mutiert und anschließend die Auswirkung der Mutationen auf die Aktivität von FgaPT2 untersucht. Der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Austausch von E89 und R100 bestätigte die essentielle Rolle dieser Reste für die Katalyse von FgaPT2. Dagegen konnte die Substitution von K174 durch Glutamin die Notwendigkeit dieser Aminosäure für den Reaktionsmechanismus nicht unterstützen.