Análise bioquímica, estrutural e funcional de CsMES1, uma metilesterase de salicilato de C. sinensis envolvida na resposta de defesa contra o cancro cítrico Biochemical, structural and functional analysis of CsMES1, a C. sinensis salicylate methylesterase involved in the defense response against citrus canker

Orientador: Celso Eduardo Benedetti Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O ácido salicílico (SA) e seu éster de metila, salicilato de metila (MeSA), são conhecidos como indutores de defesa local e sistêmica em plantas, respectivamente. SA é importante na resposta de defesa local contra microrganismos biotróficos, e sua conversão a partir de MeSA é essencial para o desenvolvimento da chamada resistência sistêmica adquirida (SAR). Essa conversão é realizada por metilesterases da família MES/SABP2. Em trabalho prévio, onde se analisou a expressão diferencial de genes de laranja doce (Citrus sinensis) em resposta a bactérias causadoras do Cancro Cítrico, identificou-se um gene que codifica uma proteína pertencente à família MES/SABP2, denominada CsMES1. CsMES1 é induzida localmente em resposta à infecção por Xanthomonas citri subsp. citri (Xc), agente causal do Cancro Cítrico em citros, mas preferencialmente induzida em resposta à infecção por Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii patotipo `C¿ (Xa), que induz uma resposta de hipersensibilidade em variedades de laranja doce. Assim, esse trabalho teve como principais objetivos avaliar o papel de CsMES1 na resposta de defesa local contra Xa e Xc, como também caracterizar bioquimicamente sua atividade enzimática. Neste?trabalho,?mostrou-se que CsMES1?não?é apenas?estruturalmente?homóloga?à proteína `Salicylic Acid-Binding Protein 2¿ de tabaco (NtSABP2), mas também catalisa a reação de conversão de MeSA em SA. Análises de modelos moleculares estruturais de CsMES1 indicam que CsMES1 e NtSABP2 apresentam a mesma tríade catalítica no sítio ativo e ligam SA de forma similar. Entretanto, verificou-se que CsMES1 possui uma menor afinidade por SA comparado à NtSABP2. Consistente com esses achados, identificou-se um polimorfismo de aminoácidos em um resíduo do sítio ativo nas proteínas da família MES de C. sinensis e outras espécies de plantas, que influencia de forma significativa a atividade metilesterásica sobre MeSA e a afinidade por SA. Através do uso de mutantes e modelagem molecular de CsMES1, verificou-se que a interação da cadeia lateral do resíduo polimórfico é dependente da hidroxila na posição orto do anel aromático de SA. Tais resultados explicam, assim, um possível papel do resíduo polimórfico na velocidade de reação como também no `feedback¿ negativo induzido pelo produto da reação. Esse trabalho mostra ainda que SA e transcritos de CsMES1 e outros genes envolvidos na via de sinalização de SA são detectados em folhas de laranja doce preferencialmente na interação incompatível com Xa, quando comparado à interação compatível com Xc. Além disso, verificou-se que aplicações de SA e MeSA em folhas de citros inibem o desenvolvimento dos sintomas do Cancro Cítrico, enquanto que um inibidor competitivo de CsMES1 aumenta a severidade desses sintomas. Os resultados, portanto, sugerem que CsMES1 e SA desempenham uma função importante na defesa local contra as bactérias causadoras do Cancro Cítrico Abstract: Salicylic acid (SA) and its methyl ester, methyl salicylate (MeSA), are known as inducers of local and systemic defense in plants, respectively. SA is important for the local defense response against biotrophic microorganisms, and its conversion from MeSA is essential in the development of systemic acquired resistance (SAR). This conversion is mediated by MeSA esterases of the MES/SABP2 family. Previous large-scale gene expression analyses of sweet orange leaves (Citrus sinensis) in response to infection by Citrus Canker pathogens have identified a gene encoding a protein belonging to the MES/SABP2 family, denominated CsMES1. CsMES1 is induced in response to Xanthomonas citri subsp. citri (Xc), the causal agent of Citrus Canker, but preferentially induced in response to Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii pathotype `C¿ (Xa), which induces a hypersensitive response in sweet oranges. Thus, the main objectives of this work were to evaluate the role played by CsMES1 in the local defense response against Xa and Xc, as well as to biochemically characterize its enzyme activity. In this work, we show that the Citrus sinensis methyl esterase CsMES1 is not only structurally related to tobacco Salicylic Acid-Binding Protein 2 (NtSABP2), but it also catalyzes the conversion of MeSA into SA. Structural molecular modeling indicates that CsMES1 and NtSABP2 share the same catalytic triad and bind SA in a similar fashion. Nonetheless, we found that CsMES1 has a lower affinity for SA compared to NtSABP2. Consistent with these findings, an amino acid polymorphism found in the active site of CsMES1-related proteins in C. sinensis and other plant species was shown to drastically affect the methylesterase activity and SA affinity in CsMES proteins. In addition, we provide evidence that the binding affinity between CsMES1 and SA is dependent on the ortho-hydroxyl group in the aromatic ring of SA. We also show that SA and transcripts of CsMES1 and other genes involved in SA signaling and response are detected in sweet orange leaves preferably during the incompatible interaction with Xa, compared with the compatible interaction with Xc. We have also shown that SA and MeSA applications inhibit the development of Canker symptoms caused by Xc, whereas a competitive inhibitor of CsMES1 increases the severity of Citrus Canker. These results thus suggest that CsMES1 and SA play an important role in local defense against Citrus Canker bacteria Doutorado Genética Vegetal e Melhoramento Doutor em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2013/22399-2 CNPEM