Proteômica baseada em espectrometria de massas na descoberta de candidatos à biomarcadores em câncer e na identificação de novos alvos de ADAM17

Orientador: Adriana Franco Paes Leme Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A espectrometria de massas aplicada à análise proteômica permite a caracterização e quantificação em larga-escala de proteínas expressas em uma determinada condição ou sistema biológico. Na presente tese, mostramos por meio de diferentes abordagens a utilidade da espectrometria de massas (1) no estudo de proteínas secretadas ou clivadas da superfície (secretoma) por células tumorigênicas como fonte de biomarcadores em câncer (2) na validação de candidatos biomarcadores em saliva humana de pacientes com câncer oral e (3) no estudo de alvos de uma metaloprotease envolvida na progressão de câncer, a ADAM17 (A disintegrin and metalloproteinase 17). Os resultados gerados pela espectrometria de massas juntamente com ferramentas estatísticas e de bioinformática para visualização de dados em agrupamento, heatmaps, rede de interação proteína-proteína, enriquecimento de vias e processos biológicos indicaram proteínas específicas direcionadas à hipótese que puderam ser validadas por métodos complementares quantitativos e funcionais. No contexto de biomarcadores em câncer, um painel de marcadores foi indicado a partir da análise do secretoma de células de carcinoma, melanoma e não cancerosas. Dentre os candidatos em carcinoma, proteínas envolvidas no sistema complemento foram validadas com expressão aumentada tanto em tecidos (proteínas C3 e CFB) quanto em saliva de pacientes com carcinoma oral de células escamosas (proteínas C3, CFB, C4B e SERPINA1). Agrina e perlecan, também observados com expressão alterada no secretoma de células de carcinoma e validados com expressão aumentada em tecidos de paciente com câncer oral, foram estudados quanto à função em processos tumorigênicos: migração, adesão, proliferação e sensibilidade à cisplatina. No estudo do degradoma da ADAM17, mimecan, perlecan e glypican-1 foram revelados como novos alvos dessa protease, e os sítios de clivagem determinados por espectrometria de massas. Além disso, funções e processos biológicos associados à clivagem de glypican-1 também foram estudados por meio da análise de seus parceiros de interação no meio extracelular seguido de ensaios funcionais. Em resumo, a espectrometria de massas esteve presente em todos os passos do método científico, desde a geração de hipóteses por meio da proteômica baseada em descoberta, até o teste e confirmação de hipóteses por meio da proteômica baseada em alvos Abstract: Mass spectrometry applied to proteomic analysis allows large-scale characterization and quantification of proteins in specific conditions or biological systems. In this thesis, we showed different mass spectrometry-based approaches for (1) the study of cell secreted or released from the cell-surface proteins (secretome) as a source of candidate biomarkers in cancer (2) validation of candidate biomarkers in human saliva of patients with oral cancer and (3) the study of the target substrates of an important metalloprotease involved in cancer progression, the ADAM17 (A disintegrin and metalloproteinase 17). Together with statistical and bioinformatics tools, such as clustering, heatmaps, network analysis and enrichment analysis, we found specific hyphothesis-driven proteins that were further validated using complementary quantitative and functional methods. In the context of cancer biomarker, a panel of candidate biomarkers was revealed from the secretome analysis of carcinoma, melanoma and non-tumorigenic cell lines. Among the carcinoma candidates, proteins involved in complement system were validated with higher expression in tissues (C3 and CFB) and saliva (C3, CFB, C4B and SERPINA1) from patients with oral squamous cell carcinoma. The function of agrin and perlecan, which were also found with increased expression in squamous cell carcinoma tissue, were studied in tumorigenic processes: migration, adhesion, proliferation and sensibility to cisplatin. In the context of ADAM17 degradome, mimecan, perlecan and glypican-1 (GPC1) were revealed as novel substrates and their cleavage sites were determined using mass spectrometry. Besides, the function and biological processes associated with GPC1 shedding were studied by identifying the binding partners of GPC1 in the extracellular media and by performing functional assays. In summary, mass spectrometry was present in all part of the scientific method, from hyphothesis generation using discovery proteomics to hyphothesis testing using targeted proteomics Doutorado Bioquímica Doutora em Biologia Funcional e Molecular FAPESP