Isolamento, caracterização e determinação de alcaloides triptoquialanina A e triptoquialanina C produzidos pelo fungo Penicillium digitatum durante infecção no hospedeiro citros

Orientadores: Taicia Pacheco Fill, Cassiana Carolina Montagner Raimundo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química Resumo: Os fungos em geral, são responsáveis por grandes perdas no pós-colheita em diversas commodities. Em especial, o Penicillium digitatum, que é responsável por até 90% das perdas totais à citricultura brasileira no pós-colheita. Durante infecção no hospedeiro citros o fitopatógeno P.digitatum sintetiza os alcaloides do tipo triptoquialaninas A e C, in vivo, o que poderia representar um problema para a população mundial, uma vez que as micotoxinas produzidas por fungos em geral são notoriamente tóxicas. Os objetivos deste trabalho foram isolar, caracterizar e desenvolver e validar um método analítico para determinação das triptoquialaninas A e C durante infecção do fungo P.digitatum em laranja (camadas: epicarpo, mesocarpo e endocarpo), avaliando o grau de difusão dessas micotoxinas em diferentes estágios de infecção. A purificação dos padrões foi realizada através de técnicas cromatográficas e os compostos foram caracterizados por técnicas de RMN (1H, 13C, HSQC, HMBC) e cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas de alta resolução (LC-HR-MS). Os padrões dos alcaloides purificados foram então utilizados para desenvolver e validar o método analítico o qual consistiu na extração dos analitos pelo procedimento QuEChERS modificado e otimizado com auxílio de planejamento experimental. A quantificação dos analitos foi realizada por cromatografia líquida acoplada a espectrômetro de massas em sequencial (LC-MS/MS). A linearidade obtida foi de 5 ¿ 400 ?g/kg com r > 0,99 para as triptoquialaninas A e C. Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) obtidos foram 5 ?g/kg e 10 ?g/kg, com exceção para o composto TC no extrato do epicarpo, onde foi obtido o LQ de 25 ?g/kg. A exatidão foi obtida por ensaios de recuperações na faixa de 58 a 101%, com desvios padrão relativo (RSDs) ? 12%. A presença dos analitos triptoquialaninas A e C na laranja, foi identificada em diferentes graus de infecção, mostrando que a difusão dos metabólitos só ocorre a partir do estágio intermediário da infecção. Além disso, a determinação dos compostos na camada do epicarpo (branco), o qual ficou em contato direto por 48 horas com laranja infectada, indicou a contaminação pelos alcaloides, após o período de exposição estudado. Os compostos triptoquialaninas A e C não demonstraram capacidades antiproliferativas e de citotoxicidade nos testes realizados (HeLa, HUVEC e K-562), o que nos sugere ausência das atividades para as células analisadas Abstract: Fungi, are responsible for large post-harvest losses in various commodities. In particular, Penicillium digitatum, which is responsible for up to 90% of the total losses to the Brazilian citrus crop in the post-harvest period. During infection in the citrus host, the phytopathogen P.digitatum synthesizes tryptoquialanines A and C alkaloids in vivo, which could represent a problem for the world population, since mycotoxins produced by fungi in general are notoriously toxic. The objective of this project was to isolate, characterize and develop and validate an analytical method to determination of tryptoquialanines A and C during the infection of the fungus P.digitatum in orange (layers: epicarp, mesocarp and endocarp), evaluating the level of diffusion of these mycotoxins in different stages of infection. Purification of the standards was performed by chromatographic techniques and the compounds were characterized by NMR (1H, 13C, HSQC, HMBC) and Liquid Chromatographic coupled to High Resolution Mass Spectrometry (LC-HR-MS) techniques. The purified alkaloid standards were then used to develop and validate the analytical method which employed the QuEChERS extraction method, modified with the aid of experimental planning and the quantification of the analytes was carried out by Liquid Chromatography coupled to Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS). The linearity obtained was 5 - 400 ?g/kg with r > 0.99 for tryptoquialanines A and C. The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were 5 ?g/kg and 10 ?g/kg, with the exception of the TC compound in the epicarp extract, where the LQ was 25 ?g/kg. The recoveries between 58 and 101%, with relative standard deviations (RSDs) ? 12% showed the accuracy of the method. The presence of the tryptoquialanines A and C was observed in different levels of infection of the orange, showing the diffusion of the metabolites occurs only from the intermediate stage of the infection. In addition, the presence of the compounds in the epicarp layer (blank), which was in direct contact for 48 hours with infected orange, showed the contamination process among oranges by the alkaloids, after this exposure period. Tryptoquialanines compounds A and C did not demonstrate antiproliferative and cytotoxicity abilities in the tests performed (HeLa, HUVEC and K-562), which suggests absence of activities for the analyzed cells Mestrado Química Analítica Mestre em Química