Differentiation between Trypanosoma cruzi and Trypanosoma rangeli using heat-shock protein 70 polymorphisms

Objective Differential diagnosis of infection with Trypanosoma cruzi or T. rangeli is relevant for epidemiological studies and clinical practice as both species infect humans, but only T. cruzi causes Chagas' disease. Their common antigen determinants complicate the distinction between both species, while current PCR assays used for differentiation show some drawbacks. We developed and validated a generic PCR discriminating the species by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis and a duplex PCR specifically amplifying a differently sized fragment of both species. Methods The assays are based upon a partial region of the heat-shock protein 70 gene (hsp70). The analytical sensitivity and specificity were determined for both PCRs. The assays were analytically evaluated on a panel of six T. cruzi, one T. cruzi marinkellei and four T. rangeli strains, various other infectious pathogens, a panel of spiked samples of T. cruzi, and artificially mixed infections of T. cruzi and T. rangeli. Finally, the tools were applied on 36 additional isolates of Trypanosoma species. Results The detection limit of the PCRs was between 0.05 and 0.5 parasite genomes, and 1–10 parasites spiked in 200 μl blood. In artificial mixtures, PCR–RFLP picked up both species in ratios up to 102 and duplex PCR up to 104. In the 36 isolates tested, both single and mixed infections were identified. All assays were shown to be specific. Conclusion Our PCRs show high potential for the differential diagnosis of T. cruzi and T. rangeli, which in view of their sensitivity can aid in the confirmation of infection with these parasites in vectors, reservoirs and clinical samples. Objectif Le diagnostic differentiel de l'infection par Trypanosoma cruzi ou T. rangeli est necessaire pour les etudes epidemiologiques et la pratique clinique car les deux especes infectent les humains, mais seul T. cruzi provoque la maladie de Chagas. Leurs determinants antigeniques communs compliquent la distinction entre les deux especes, alors que les tests actuels de PCR, utilises pour la differenciation montrent quelques inconvenients. Nous avons developpe et valide une PCR generique permettant de discriminer les especes par le polymorphisme de la taille des fragments de restriction (RFLP) et par un PCR duplex amplifiant specifiquement un fragment de taille differente pour les deux especes. Methodes Les tests sont bases sur une region partielle du gene de la proteine heat-choc 70 (hsp70). La sensibilite et la specificite analytique ont ete determinees pour les deux PCR. Les tests ont ete evalues analytiquement sur un ensemble de 6 souches de T. cruzi, 1 souche de T. cruzi marinkellei et 4 souches de T. rangeli, ainsi que divers autres agents pathogenes infectieux, une serie d’echantillons enrichis de T. cruzi et de melanges artificiels d'infections par T. cruzi et T. rangeli. Enfin, les outils ont ete appliques sur 36 isolats supplementaires d'especes Trypanosoma. Resultats La limite de detection de la PCR etait comprise entre 0,05 et 0,5 genomes de parasites, et de 1 a 10 parasites enrichis dans 200 μl de sang. Dans les melanges artificiels, la PCR-RFLP a detecte les deux especes dans des proportions allant jusqu’a 102 et la PCR duplex, dans des proportions allant jusqu’a 104. Sur les 36 isolats testes, les infections uniques et mixtes ont ete identifiees. Tous les tests ont ete trouves specifiques. Conclusion Nos PCR montrent un fort potentiel pour le diagnostic differentiel de T. cruzi et T. rangeli, qui en raison de leur sensibilite pourraient aider a la confirmation de l'infection par ces parasites chez les vecteurs, dans les reservoirs et dans les echantillons cliniques. Objetivo El diagnostico diferencial de la infeccion por Trypanosoma cruzi o T. rangeli es relevante para estudios epidemiologicos y la practica clinica, puesto que ambas especies infectan a los humanos pero solo T. cruzi causa la enfermedad de Chagas. Sus determinantes antigenicos comunes complican la distincion entre ambas especies, mientras que los ensayos de PCR actualmente utilizados para diferenciarlos presentan problemas. Hemos desarrollado y validado una PCR generica que discrimina entre las especies mediante un analisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion (RFLP) y una PCR-Duplex que amplifica especificamente fragmentos de tamanos diferenciados en ambas especies. Metodos Las pruebas estan basadas en una region parcial del gen de la proteina de choque termico 70 (hsp70). Para ambas PCRs se determinaron la sensibilidad y especificidad analitica. Las pruebas fueron evaluadas de forma analitica en un panel de 6 cepas de T. cruzi, 1 de T. cruzi marinkellei y 4 de T. rangeli, otros patogenos infecciosos, un panel de muestras a las que se anadio T. cruzi, y mezclas artificiales de T. cruzi y T. rangeli. Finalmente las herramientas se aplicaron en 36 aislados adicionales de especies de Trypanosoma. Resultado El limite de deteccion de las PCRs estaba entre 0.05 y 0.5 genomas de parasito y 1 a 10 parasitos en 200 μl de sangre. En mezclas artificiales, la PCR-RFLP detecto ambas especies en una proporcion de hasta 102 y la PCR-Duplex de hasta 104. En los 36 aislados evaluados se identificaron tanto las infecciones unicas como las mixtas. Todas las pruebas eran especificas. Conclusion Nuestras PCRs muestran un gran potencial para el diagnostico diferencial de T. cruzi y T. rangeli, lo cual dado su nivel de sensibilidad podria ayudar a la confirmacion de la infeccion con estos parasitos en vectores, reservorios y muestras clinicas.