Efeito da inibição da enzima JAK2 sobre a morte neuronal, astrogliose e neurogênese no estriado de camundongos adultos após injeção unilateral de ácido quinolínico

Orientadores: Fabio Rogério, Carlos Amilcar Parada Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A injeção de ácido quinolínico (AQ), um agonista glutamatérgico do receptor N-metil-D-aspartato, no estriado de roedores induz morte seletiva de neurônios espinhosos médios, gliose reativa e neurogênese na zona subventricular, acompanhada da migração dos neurônios recém-gerados para o estriado lesado. Tais achados são também descritos na doença de Huntington (DH). Há indícios de que a via de sinalização JAK/STAT esteja envolvida no mecanismo de ação do AQ, bem como na patogênese da DH. A interação das citocinas da família da IL-6 com seus receptores desencadeia a ativação de enzimas da família das Janus-Quinases (JAKs), que por sua vez permitem o recrutamento e a ativação de fatores de transcrição da família das proteínas transdutoras de sinais e ativadoras da transcrição (STATs). Embora as principais características da DH sejam a presença da coréia e déficits na execução de movimentos voluntários, poucos testes são realizados abordando o comportamento locomotor dos animais no modelo de lesão por AQ. Neste trabalho, estudamos o efeito do AG490, um inibidor da JAK2, na gliose, perda neuronal e neurogênese no estriado de camundongos adultos C57BL/6J após a administração estereotáxica unilateral de AQ (30nmol). Imediatamente após a lesão, os animais receberam uma injeção subcutânea de AG490 (10mg/kg) ou veículo (PBS+DMSO), e injeções diárias por 6 dias adicionais. Além disso, investigamos o possível efeito da lesão por AQ na atividade física voluntária diária (AFVD) em rodas de atividade. A distância percorrida pelos camundongos foi monitorada por 28 dias após a injeção unilateral de QA (30nmol) ou PBS no estriado. Cortes coronais do cérebro (40?m) obtidos em criostato foram utilizados para quantificação de neurônios por estereologia e para a análise de expressão protéica, através de imunoistoquímica e Western Blotting para GFAP e doublecortina, marcadores de gliose e neuroblastos, respectivamente. A área total de células doublecortina-positivas (ACDP) e o número de neurônios (NN) no lado lesado (L) e contralateral à lesão (CL) foram avaliados. O Índice de Neurogênese (IN=ACDP(L)/ACDP(CL)) e o Índice de Sobrevivência Neuronal (ISN=NN(L)/NN(CL)) foram calculados. Após a administração de AQ, o estriado ipsilateral apresentou intensa gliose e células doublecortina positivas com características de células migratórias. O Western Blotting para GFAP mostrou uma redução ipsilateral de 19% nos animais tratados com AG490, em comparação aos animais do grupo tratado apenas com veículo (0.82±0.05; 1.010±0.06, n=9, p0.05). Portanto, nossos resultados suportam um papel para a JAK2 na morte neuronal, gliose, e neurogênese estriatais após lesão com AQ. O tratamento com o inibidor AG490 causou neuroproteção e diminuição da gliose, sugerindo que a reação astrocitária pode prejudicar a sobrevivência neuronal neste modelo experimental Abstract: Injection of quinolinic acid (QA), a N-methyl-D-aspartate receptor agonist, in murine striatum induces death of medium spiny neurons, gliosis and neurogenesis in the subventricular zone with migration of newly synthesized neurons to damaged striatum. Such findings are also described in Huntington's disease (HD). The Janus-kinase (JAK) pathway would take part in QA mechanism of action and HD pathogenesis as well. The interaction of interleukin-6 family of cytokines with its receptor triggers the activation of enzymes of the family of JAKs, which in turn allow the recruitment and activation of transcription factors, known as signal transducers and activators of transcription (STATs). Although the main features of HD are the presence of chorea and deficits in performing voluntary movements, few tests are realized regarding locomotor behavioral on QA model. We studied the effect of AG490, an inhibitor of JAK isoform 2 (JAK2), on gliosis, neuronal loss and neurogenesis in the striatum of adult C57BL/6J mice after unilateral estereotaxic administration of QA (30 nmol). Immediately after injury, animals received a subcutaneous injection of AG490 (10 mg/kg) or vehicle (PBS + DMSO), and then once daily injections for 6 days. Furthermore, in a parallel experiment, we investigated the possible effect of the lesion by AQ on the voluntary daily physical activity (VDPA) in running wheels. The distance traveled by mice was monitored daily for 28 days after unilateral injection of QA (30 nmol) or PBS into the striatum. Frozen brain sections (40?m) were used for neuronal stereological quantification and immunohistochemical and Western Blotting analyses for GFAP and doublecortin, markers of gliosis and neuroblasts, respectively. The total area of doublecortin-positive cells (ADPC) and the number of neurons (NN) in the lesioned (L) and contralateral (CL) sides were evaluated. Neurogenesis index (NI = ADPC in L/ ADPC in CL) and neuronal survival ratio (NSR = NN in L/ NN in CL) were calculated. After QA administration, ipsilateral striatum showed intense gliosis and doublecortin-positive cells with few processes and ovoid bodies, morphological features corroborating a migratory activity. Western Blotting for GFAP showed an ipsilateral decrease of 19% in AG490- vs vehicle-treated animals (0.82 ± 0.05 vs 1.010 ± 0.06; n=9, p 0.05). In conclusion, our results support a role for JAK2 in striatal neuronal death, gliosis and neurogenesis determined by QA. AG490 caused neuroprotection and reduced gliosis suggesting that astrocytic reaction may impair neuronal survival in the present experimental model Mestrado Fisiologia Mestre em Biologia Funcional e Molecular