Biologisk effekt og karakterisering av polyfenoler fra Hypericum maculatum

Bakgrunn: Hypericum maculatum (firkantperikum) er en flerårig urt med utbredelse over store deler av Europa. Planten har lang tradisjon som medisinplante, og sammenlignes ofte med Hypericum perforatum (prikkperikum) som ligner både i utseende og kjemisk sammensetning. Hensikten med oppgaven var å isolere og karakterisere polyfenoler i H. maculatum, og undersøke antiinflammatorisk aktivitet og effekter på tarmmikrobiota in vitro. Metoder: Tørket overjordisk del av H. maculatum ble pulverisert på en slipemølle og ekstrahert med 70 % etanol (EtOH). EtOH-kstraktet ble suspendert i vann og væske-væske ekstrahert med diklormetan (DCM), etylacetat (EtOAc) og butanol (BuOH). BuOH- og EtOAc-fasene ble videre renset opp og fraksjonert med ulike kolonnekromatografiske metoder for isolering av substanser i planten. Innholdsstoffene ble strukturelt karakterisert og identifisert ved NMR-spektroskopiske metoder som 1H, 13C, 13C APT, COSY, HSQC, HMBC og NOESY. Antiinflammatorisk aktivitet ble bestemt ved å måle reduksjon i konsentrasjon av NO i LPS stimulerte J774A.1 makrofager. For å avkrefte at cytotoksisk effekt var årsaken til en eventuell NO-reduksjon, ble MTT-test utført for å bestemme viabilitet for cellene Effekten av polyfenoler på tarmmikrobiota ble undersøkt ved Institutt for biovitenskap, UiO. Ekstrakter og isolerte stoffer ble tilsatt til in vitro kulturer av tarmmikrobiota, og mengde bakteriearter i disse ble bestemt ved sekvensering. Resultat og diskusjon: Det identifisert ti forbindelser: epicatechin, acetylannulatophenoside, hyperosid, quercitrin, guaijaverin, procyanidin B2, I3, II8’’-biapigenin, quercetin, klorogensyre og neoklorogensyre. Alle de isolerte stoffene er tidligere blitt rapportert i H. maculatum. HPLC analyse av EtOH-ekstraktet viste et høyt innhold av hyperosid og quercetin. De biologiske testene ble gjennomført på hovedfraksjonene og fem av de isolerte stoffene: klorogensyre, hyperosid, epicatechin, quercetin og acetylannulatophenoside, og en proanthocyanidin rik fraksjon fra BuOH-fasen. EtOH-ekstraktet, EtOAc- og BuOH-fasene ga en reduksjon av NO-konsentrasjonen ved 50 µg/ml og 100 µg/ml, mens ved 100 µg/ml var EtOAc- og BuOH-fasene cytotoksiske. DCM-fasen var cytotoksisk med 2,0 -11,2 % celleviabilitet ved alle konsentrasjoner målt. Vann-fasen hadde liten NO–hemmende effekt og høy celleviabilitet. I MTT testen for de isolerte substansene ble det observert liten cytotoksisk effekt, unntak av proanthocyanidin-fraksjon ved 100 µM. Av de isolerte stoffene hadde klorogensyre og quercetin sterkest NO-hemmende effekt ved 100 µM med henholdsvis 69,1% og 75,6 % hemming. Hyperosid og acetylannulatophenonoside viste lav NO-hemmende aktivitet, og epicatechin avviket fra et forventet dose-respons resultat. Mikrobiotaforsøket var et pilotforsøk hvor det ble observert en reduksjon i mengde Clostridiaceae bakterier og økt mengde Ruminococcaceae og Lachnospiraceae etter inkubering med BuOH-fasen, epicatechin og klorogensyre. Quercetin ga en økning av Ruminococcaceae, hyperosid ga en økning av Lachnospiraceae og reduksjon av Clostridiaceae bakterier, mens DCM-fasen og vandig rest reduserte mengde Clostridiaceae og økte mengden av Ruminococcaceae bakterier. Resultatene var ikke signifikant forskjellige fra kontroll, og forsøket må gjentas med flere paralleller for å bekrefte funnene. De biologiske forsøkene viser at quercetin muligens er den viktigste bidragsyteren til en antiinflammatorisk effekt i H. maculatum. Ekstrakter og polyfenoler fra planten kan muligens påvirke vekst av mikroorganismer i tarm, men flere studier må uføres for å bekrefte dette.