Untersuchung der Proteine der CCC1-like Familie und deren Funktion als putative Eisentransporter

Mitglieder der CCC1 like Proteinfamilie sind Metalltransportproteine und Homologe zum vakuolären Eisen- und Mangantransporter CCC1 aus S. cerevisiae. VIT1-Homologe als CCC1-like Proteine pflanzlicher Herkunft können eine Anwendung in der Eisen-Biofortifikation finden. Bei der Überexprimierung von TaVIT2 in Weizen wurde von der 4 fachen Erhöhung des Eisen- und Mangangehalts im Mehl berichtet (Connorton et al., 2017). Die Überexprimierung von OsVIT1 oder OsVIT2 in Reis hat zur Erhöhung sowohl vom Eisengehalt als auch von Zink- und Mangangehältern geführt (Zhang et al., 2012). In dieser Arbeit wurden 6 CCC1-like Proteine aus A. thaliana bezüglich ihrer Substratspezifität untersucht. VIT1 und fünf VIT-Like Proteine (VTLs) wurden an ihren N- und C Termini modifiziert und im Hefekomplementationsverfahren auf ihre Fähigkeit Eisen, Mangan oder Zink zu transportieren untersucht. Ein einfacher Algorithmus zur Modifizierung von Membranproteinen durch Entfernung mehrerer AS-Reste vom N- bzw. vom C-Terminus ist beschrieben. Es sollte untersucht werden, ob diese Modifizierung einen Einfluss auf die Hefekomplementation hat. Native und modifizierte VTLs wurden mittels GFP-Fusion in den Zelllokalisierungsstudien untersucht. Es sollte festgestellt werden, ob Modifikationen die Zelllokalisierung beeinflussen. Eine Lokalisierung an der Vakuolenmembran wurde für VIT1, VTL1-4 und für einige modifizierte VTL4-Konstrukte nachgewiesen. Dagegen zeigte das VTL5-Konstrukt vorwiegend eine Plasmamembranlokalisierung. Die Entfernung von 21 AS vom N Terminus von VTL4 bzw. von 23 AS vom N-Terminus von VIT1 hatten keinen Effekt auf die Komplementation der Δccc1 Mutante. Dagegen zeigten die entsprechenden Konstrukte keine Komplementation der Δpmr1 Mutante. Es wurden modifizierte Konstrukte von AtVIT1 und AtVTL4 gefunden, die nicht in der Lage waren Mangan und Zink zu transportieren und dadurch für Eisen spezifisch gewesen wären. Diese wären gute Kandidaten für eine eisenselektive Biofortifikation. CCC1 like protein family are metal transport proteins with high homology to the S. cerevisiae vacuolar iron and manganese transporter CCC1. The plant members of this family such as VIT1-homologue might find an application in iron biofortification of crops. An almost 4-fold increase in the iron content in flour of TaVIT2 overexpressing wheat was demonstrated (Connorton et al., 2017), but the overexpressing plants showed a significant increase in manganese content as well. OsVIT1 or OsVIT2 overexpressing in rice (Zhang et al., 2012) lead to increased iron, zinc and manganese. In this thesis six member of A. thaliana CCC1-like proteins were investigated for their substrate specificity. VIT1 itself and five other VIT1-like proteins (called VTLs) were modified at their N- and C-termini and investigated for iron, manganese and zinc transport capacity via a yeast complementation assay. A simple algorithm to modify membrane proteins by removing AA rests from their N- and / or C-terminal regions is presented, and the effects of these modifications on the functionality of the modified protein by the yeast complementation test are reported. The cell localization of native and modified VTLs was studied using fusion to GFP to determine if modifications would alter the subcellular localization in yeast. VTL1-4 as well as VIT1 were localized to the vacuolar membrane of yeast cell. VTL5 was predominantly localized to the plasma membrane of the yeast cell. Some modified VTL4 constructs could still be localised to the vacuolar membrane. Removal of 21 AA from the N-terminus of AtVTL4 as well as removal of 23 AA from the N-terminus of AtVIT1 didn't affect the complementation of the Δccc1 mutant. In contrast no complementation of Δpmr1 mutant was seen with the same constructs. Certain modified forms of AtVIT1 and AtVTL4 were unable to transport either manganese or zinc. We propose that they might be iron-specific, and thus would be candidates for a selective iron biofortification.