Identifizierung von Interaktionspartnern des response Regulators RegA aus Rhodobacter capsulatus

Rhodobacter capsulatus ist ein fakultativ phototrophes Purpurbakterium, das unter anaeroben Bedingungen in der Gegenwart von Licht in der Lage ist, eine anoxygene Photosynthese zu betreiben. Fällt der Sauerstoffpartialdruck in der Umgebung unter einen Schwellenwert, so beginnt Rhodobacter mit der Herstellung der Photosynthesekomplexe. In der sauerstoff-regulierten Synthese des Photosyntheseapparates spielt das RegB/RegA-Zweikomponentensystem eine wichtige Rolle. Die membrangebundene Sensorkinase RegB autophosphoryliert wenn der Sauerstoffgehalt der Umgebung fällt und überträgt eine Phosphatgruppe auf den response Regulator RegA. Phosphoryliertes RegA reguliert dann die Transkription von zahlreichen Zielgenen. Zu diesen Zielgenen gehören, neben den Genen, die zur Herstellung des Photosyntheseapparates benötigt werden, auch solche Gene, die für Stickstoff-Fixierung, Kohlendioxid-Fixierung und eine Reihe weiterer Prozesse, notwendig sind. RegA ist damit ein globaler Transkriptionsregulator, der die Transkription zahlreicher verschiedener Gene bei niedrigem Sauerstoffpartialdruck aktiviert bzw. in einigen Fällen auch reprimiert. Neben dem RegB/RegA Zweikomponentensystem sind eine Vielzahl weiterer Faktoren an der Regulation der einzelnen Gene beteiligt. Daher ist es denkbar, dass der response Regulator RegA eine Wechselwirkung mit anderen Proteinen eingeht, um eine spezifische Regulation der einzelnen Prozesse zu gewährleisten. Für die Suche nach solchen interagierenden Proteinen wurde in dieser Arbeit das Hefe 2-Hybridsystem eingesetzt. Mit dieser Methode konnte der response Regulator NtrX als Interaktionspartner von RegA identifiziert werden. Das zugehörige Zweikomponentensystem bestehend aus der Sensorkinase NtrY und dem response Regulator NtrX ist in Azorhizobium caulinodans an der Regulation von Stickstoff-Fixierungsgenen beteiligt. Zur transkriptionellen Regulation dient in A. caulinodans der nifA-Promotor, der in R. capsulatus unter anderem unter der Kontrolle des RegB/RegA-Zweikomponentensystems steht. Die Interaktion von RegA und NtrX konnte anschließend mit einem GST-pulldown assay verifiziert werden, bei dem eine Kopräzipitation beider Proteine in vitro festgestellt werden konnte. NtrX-Deletionsmutanten von R. capsulatus zeigten deutlich veränderte Zusammensetzungen innerhalb der Photosynthesekomplexe, die abhängig vom Ammoniumgehalt des verwendeten Mediums waren. Weiterhin wiesen die NtrX-Mutanten höhere Mengen an Photosynthesekomplexen auf, verglichen mit dem Wildtyp. Bei einer Überexpression von NtrX in R. capsulatus dagegen ist die Menge an Photosynthesekomplexen um 30 % niedriger als im Wildtypstamm. NtrX könnte also ein negativer Regulator der Photosynthesegenexpression sein. Eine NtrX-Variante, bei der die putative Phosphorylierungsstelle D52 gegen Glutamat ausgetauscht wurde, zeigte in Gelretardationsexperimenten eine Bindung an den Promotor des Photosynthese-Operons puf (kodiert u. a. Proteine für Antennenkomplex I und Reaktionszentrum). Diese DNA-Bindung von NtrX deutet darauf hin, dass das Protein durch direkte Wechselwirkung mit der Ziel-DNA einen Einfluss auf die Menge der Photosynthesekomplexe nehmen kann. Rhodobacter capsulatus is a facultatively phototrophic purple bacterium. It is able to perform anoxygenic photosynthesis under anaerobic conditions in the presence of light. The formation of pigment protein complexes in facultatively photosynthetic bacteria of the genus Rhodobacter is only induced when the oxygen tension drops below a threshold value. In R. capsulatus the sensor kinase RegB autophosphorylates in a redox-dependent manner. It then transfers the phosphatidyl residue to the response regulator RegA, a DNA binding protein which activates transcription of a number of genes for pigment binding proteins and for pigment syntheses. Among the genes activated by RegA at low oxygen tension are the genes of the puf and puc operons. The puf operon comprises genes encoding pigment binding proteins of the light harvesting (LH) I complex and of the reaction center complex, and regulatory proteins. Genes required for the formation of the LH II complex are part of the puc operon. The RegB/RegA two component system is also involved in redox-dependent regulation of genes for nitrogen fixation, Calvin cycle enzymes, hydrogenase, and for enzymes of the respiratory chain. In order to test whether the coregulation of different redox-controlled regulons also involves a direct interaction of regulatory proteins the yeast two-hybrid system was applied to search for proteins interacting with the response regulator RegA. NtrX, the response regulator of the NtrY/NtrX two component system was identified as interaction partner of RegA. In Azorhizobium caulinodans the NtrY/NtrX two component system is involved in the regulation of nitrogen fixation genes. The interaction of RegA and NtrX was confirmed by GST pulldown experiments. To learn more about the role of NtrX in R. capsulatus, Rhodobacter strains were constructed, which harbor a knock-out of the chromosomal ntrX gene. These mutants showed a different composition of their photosynthetic components compared to the wild type. The change in composition was dependent on the amount of ammonium added to the medium. Additionally, all NtrX mutants showed more photosynthetic complexes than the wild type strain. When NtrX was overexpressed in R. capsulatus the cells contained lower amounts of photosynthetic complexes than wild type cells. NtrX seems to be a negative regulator of the photosynthetic complexes in R. capsualtus. Since NtrX has a typical helix-turn-helix motif for DNA-binding, gel retardation assays should show, whether NtrX can directly interact with the promoter regions of the photosynthesis operons puf and puc. An interaction of NtrX with the puf promoter region was only detectable, when a NtrX variant was used in the gel retardation assay. This NtrX variant harbored an amino acid exchange at the putuative phosphorylation site of the protein so that the conserved aspartate at position 52 was changed to glutamate. Theses results lead to the suggestion that the NtrX mediated negative regualtion of photosynthetic complexes in R. capsulatus is due to a direct interaction of NtrX with the puf promoter region.