Charakterisierung des molekularen Motors Myosin-V mittels Laser-Pinzette und Fluoreszenzmikroskopie

Das Motorprotein Myosin-V transportiert intrazelluläre Stoffe unter ATP-Hydrolyse in diskreten, ungefähr 36 nm großen Schritten entlang von Aktinfilamenten. Um einen besseren Einblick in den chemomechanischen Zyklus dieses Motors zu bekommen, wurden in dieser Arbeit optische und mechanische Einzelmolekülexperimente an Myosin-V durchgeführt. Dazu wurde zuerst eine optische Pinzette in Verbindung mit einem „Total Internal Reflection Fluorescence“(TIRF)-Mikroskop konzipiert und aufgebaut. Ein neuartiger Kraft-Feedback erlaubte erstmals ganze Läufe des Motorproteins über mehrere Mikrometer und unter verschiedenen vorwärts- und rückwärtsgerichteten Kräften aufzuzeichnen. Das räumliche Auflösungsvermögen des neuen Feedbacks lag bei ~3 nm, die zeitliche Auflösung bei ~10 ms, wobei typischerweise Federkonstanten zwischen 0.02 pN/nm und 0.08 pN/nm verwendet wurden. Über das integrierte TIRF-Mikroskop mit zwei Anregungslasern konnten einzelne Cy3- bzw. Cy5-Fluorophore bei einer Konzentration bis zu 50 nM mit einer Zeitauflösung von ~100 ms und einer räumlichen Auflösung von ~20 nm ~10 s lang beobachtet werden. Eine zentrale Frage bei prozessiven Motoren ist, wie sich die beiden Arme beim Laufen koordinieren. Einerseits könnte es sich um eine sogenannte „Hand-über-Hand“-Bewegung handeln, bei der der hintere Arm nach vorne schwingt und zum vorderen Arm wird. Andererseits wurde eine Bewegung ähnlich einer Raupe vorgeschlagen, bei der der hintere Kopf an etwa die Position des vorderen gelangt und der vordere Kopf nach vorne ausweicht. In dieser Arbeit wurden Einzelmolekülfluoreszenz-Experimente durchgeführt, die das raupenähnliche Modell für Myosin-V ausschließen und das „Hand-über-Hand“-Modell bestärken. In weiteren Experimenten wurden mittels einer optischen Pinzette an einzelne, aktive Motorproteine verschiedene vorwärts- und rückwärtsgerichtete Kräfte angelegt. Dabei konnten erstmals ganze Läufe des Myosin-V im Mikrometerbereich aufgezeichnet und in Hinsicht auf Schrittweiten, Verweildauern, und Lauflängen untersucht werden. Die breiten Schrittweitenverteilungen zeigen, dass Myosin-V seine diskreten Schritte überraschend flexibel gestalten kann. Im Mittel ist die Periodizität des Aktinfilaments von ungefähr 36 nm aber in weiten Kraftbereichen gut reproduziert. Erst bei Kräften sehr nahe der Anhaltekraft zeigen die Schrittweitenverteilungen einen Einbruch hin zu kleineren Schritten. Die Analyse der Verweildauern ergibt zwei kraftabhängige Ratenkonstanten, die mit ADP-Loslösen und dem diffusiven Suchen der Motordomäne nach der Bindungstasche am Aktin identifiziert werden können. Die limitierende Ratenkonstante ADP-Loslösen ist dabei nur schwach kraftabhängig, während die Ratenkonstante für das diffusive Suchen der Motordomäne nach der Bindungstasche am Aktin stärker kraftabhängig ist. Diese Kraftabhängigkeiten lassen Rückschlüsse auf die mit den Ratenkonstanten verbundene Bewegung des Moleküls zu. Dabei ergibt sich, dass mit ADP-Loslösen keine nennenswerte Bewegung des Moleküls einhergeht, während das diffusive Suchen mit einer charakteristischen Distanz von ~3 nm verbunden ist. Zur Erklärung dieser Ergebnisse und für weitere Einblicke in den chemomechanischen Zyklus werden einige analytische Abschätzungen gemacht, bei denen die Arme des Myosin-V als elastische, am Aktin eingespannte oder drehbar gelagerte Balken mit angreifendem Drehmoment behandelt werden. Die experimentell bestimmten Lauflängenverteilungen zeigen ein einfachexponentielles Verhalten, wobei die Lauflängen mit einer charakteristischen Länge von etwa 10 Schritten weitgehend kraftunabhängig sind. Bei diesen Experimenten wurde weiterhin untersucht, wie sich Myosin-V, das in vivo beim Melanosomentransport zusammen mit sehr viel stärkeren Motoren wie Kinesinen gefunden wurde, bei Kräften weit über der Anhaltekraft verhält. Bei hohen Rückwärtskräften zeigt sich ein neues Phänomen. Myosin-V führt mehrere, aufeinander folgende Rückwärtsschritte aus, was darauf schließen läßt, dass externe Kräfte den mechanischen Schlag des Moleküls umkehren können. The motor protein Myosin-V transports intracellular particles in discrete steps that are app. 36 nm long along actin filaments while hydrolysing ATP. To gain a better insight into the chemo-mechanical cyle of this motor, optical and mechanical single molecule experiments were performed in this PhD work. To perform these experiments an optical tweezers setup in combination with a “Total Internal Reflection Fluorescence”(TIRF)-microscope was first planed and built. A new long range force feedback allowed the oberservation of full runs of Myosin-V under different forward and backward forcesfor the first time. The spacial resolution was ~3 nm, the time resolution ~10 ms and the spring constants typically used were between 0.02 and 0.08 pN/nm. Single Cy3- and Cy5-fluorophores with a concentration up to 50 nM could be observed for around 10 s with a time resolution of ~100 ms and a spacial resolution of ~20 nm by the integrated two colored TIRF-microscope. One of the central questions of processive motors is “how does the two lever arm coordinate?”. There are two proposed mechanisms. First, a so-called “hand-over-hand”-movement occurs. This means the rear head swings in front and becomes the leading head. In the second proposed mechanism an inchworm like movement occurs. In this mechanism the rear head reaches the position of the leading head and the leading head moves forward. The single molecule fluorescence experiments described in this thesis disprove the inchworm model but are consistent with the “hand-over-hand”-model. Experiments in which different forward and backward forces where applied on single, active motor proteins by using optical tweezers, provided insight into the chemo-mechanical cycle. For the first time full runs of Myosin-V in the micrometer range were described and analyzed with respect to step sizes, dwell times and run length. This analysis shows that Myosin-V does not have only one step size but demonstrates a broad distribution of step sizes. However, in average the actin helix periodicity of around 36 nm is well reproduced using a wide range of forces. Only at forces very near to the stall force, the step size distribution shifts to a smaller size. Analysis of the dwell times gives two force dependent rates, which can be identified as ADP-release and the diffusive search of the motor domain for the actin-binding site. The limiting rate ADP-release is only weakly depentent on the force, the diffusive search of the motor domain for the actin-binding site shows a stronger dependence on the force. >From the force dependences one can draw conclusions about the molecule movement associated with the rates. As a result ADP-release is not associated with an appreciable movement of the molecule. In contrast the diffusive search is related to a characteristic distance of ~3nm. To explain these results and to gain further insight into the chemo-mechanical cycle a couple of analytical estimates are made. In this estimates the lever arms of the Myosin-V are modelled as clamped or pivoted elastic rods at the actin filament, which are then affected by a torque. The experimentally observed run length distributions show a single exponential behavior. With a characteristic run length of around 10 steps the run length is largely independent of the load. Further more the behavior of Myosin-V, which co-localizes in the context of melanosome transport with much stronger motors like kinesin, was observed under superstall forces. At high backward forces a new phenomenon was observed, Myosin-V runs backwards, indicating a force-driven reversal of the power-stroke is possible.