Identification of genes in Burkholderia cepacia important for the formation of biofilms on abiotic surfaces

Die Bildung von Biofilmen durch Bakterien ist die Ursache vieler chronischer Infektionen. Die beiden opportunistisch pathogenen Bakterien Burkholderia cepacia und Pseudomonas aeruginosa bilden oft gemischte Biofilme in den Lungen von Personen, die an zystischer Fibrose (CF) leiden. Um Gene zu identifizieren, die an der Biofilmbildung von B. cepacia beteiligt sind, wurde eine Transposon-Mutantenbank in einem klinischen Isolat angelegt. 13 Mutanten wiesen Defekte in der Bildung von Biofilmen auf einer Polystyrol-Oberfläche auf. Die Sequenzanalyse der die Transposons flankierenden DNA erlaubte im Fall von elf der Mutanten eine Identifizierung der inaktivierten Gene. Es zeigte sich, dass neben der Zelloberfläche (Zelloberflächenproteine und Zellmembran) und der Zellform auch regulatorische Faktoren eine Rolle bei der Biofilmbildung spielen. Da die verwendete Screeningmethode die Isolierung von Mutanten mit Defekten in späten Stadien der Biofilmbildung begünstigte, sind die identifizierten Gene vorwiegend an der Reifung von Biofilmen beteiligt. Dies wurde auch durch die Untersuchung der dreidimensionalen Strukturen von Mutantenbiofilmen bestätigt: sie alle zeigten deutliche Abweichungen von der Architektur des vom Wildtyp gebildeten Biofilms. Viele Bakterien nutzen N-Acyl-homoserinlacton-Signalmoleküle (AHL) zur Zell-Zell-Kommunikation, um die Expression von Genen in Abhängigkeit von der Zelldichte zu koordinieren. Dieser Vorgang wird als Quorum sensing (QS) bezeichnet. Die Beobachtung, dass fünf der regulatorischen Mutanten stark reduzierte Mengen von AHL-Molekülen produzierten, weist auf die zentrale Bedeutung von QS für die Bildung ausgereifter Biofilme durch B. cepacia hin. Eine der C8-HSL-negativen Mutanten trug eine Transposoninsertion im QS-Regulator cepR. Die anderen vier waren in offenbar dem cep-System übergeordneten Genen mutiert, was einen Einblick in die Komplexität der QS-Regulationskaskade bei B. cepacia erlaubte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass in gemischten Biofilmen aus B. cepacia und P. aeruginosa auch artübergreifende Kommunikation stattfindet. Da Quorum sensing von beiden Arten auch zur Regulation der Expression von Virulenzfaktoren genutzt wird, kann dieser Vorgang die Pathogenität des gemischten Zellverbundes entscheidend beeinflussen. The formation of biofilms by bacteria is the cause of many chronic diseases. The opportunistic pathogens Burkholderia cepacia and Pseudomonas aeruginosa often form mixed biofilms in the lungs of patients suffering from cystic fibrosis (CF). In order to identify genes involved in the formation of biofilms by B. cepacia a transposon mutant bank based on a clinical isolate was created. 13 mutants were defective in the formation of biofilms on a polystyrene surface. The sequence analysis of the DNA flanking the transposons allowed an identification of the inactivated genes for 11 mutants. It could be shown that beside the cell surface (cell surface proteins and cell membrane) and the cell shape also regulatory factors play a role in biofilm formation. Most of the genes identified are involved in the maturation of biofilms as the screening method applied favoured the isolation of mutants with defects in the late stages of biofilm formation. This finding was confirmed by studying the three dimensional structures of mutant biofilms: all of them were clearly different from the architecture of the biofilm formed by the wild type. Many bacteria employ N-acyl-homoserinelactone signal molecules (AHLs) for cell-cell communication in order to coordinate the expression of genes with cell density, a process termed quorum sensing (QS). The observation that five of the regulatory mutants produced greatly reduced amounts of AHLs indicates a central role of QS for the formation of mature biofilms by B. cepacia. One of the AHL negative mutants was mutated in the QS regulator cepR. The remaining four mutants were obviously mutated in genes encoding higher level regulators of the cep system. This provided an insight into the complexity of the QS regulatory cascade in B. cepacia. Moreover it could be shown that interspecies communication is taking place in mixed biofilms of B. cepacia and P. aeruginosa. This process can greatly influence the pathogenicity of this mixed consortium, as QS is used by both species for the regulation of the expression of virulence factors.