Klonierung und Charakterisierung der Flavonoid 3'-Hydroxylase und der Flavonoid 3',5'-Hydroxylase

Flavonoide sind eine wichtige Klasse sekundärer Pflanzenstoffe, die in allen höheren Pflanzen vorkommen. Bis heute sind mehr als 6400 verschiedene Verbindungen bekannt. Anthocyane, farbige Flavonoide, stellen die wichtigsten Blütenfarbstoffe dar. Sie verleihen Blüten eine rosa, rote, malvenfarbige und blaue Färbung und locken Bestäuber an. Darüber hinaus besitzen Anthocyane, wie alle anderen Flavonoide, zahlreiche wichtige Eigenschaften für Pflanzen, wie z.B. der Schutz vor UV-B-Strahlung und Pflanzenschädlingen. Die am weitesten verbreiteten Anthocyane sind durch das Hydroxylierungsmuster des B-Ringes des Flavonoidgrundgerüsts charakterisiert. Die Hydroxylierung des B-Ringes wird durch die Aktivität der zwei Cytochrom P450-Enzyme Flavonoid 3'-Hydroxylase (F3'H) und Flavonoid 3',5'-Hydroxylase (F3',5'H) kontrolliert. Ohne die Aktivität eines dieser Enzyme wird hauptsächlich das 4'-hydroxylierte Anthocyan Pelargonidin gebildet, welches für viele rosa und orange Blütenfarben verantwortlich ist. Die Aktivität der F3'H führt vorwiegend zu der Bildung von Cyanidin (3',4'-hydroxyliert) und die Aktivität der F3',5'H vorwiegend zu der Bildung von Delphinidin (3',4',5'-hydroxyliert). Cyanidin verleiht Blüten rote und malvenfarbige Farben, Delphinidin ist das vorherrschende Pigment in vielen blauen Blüten. Ziel dieser Arbeit war es die F3'H und die F3',5'H durch die Klonierung der entsprechenden cDNA-Klone aus verschiedenen Pflanzen zu isolieren und durch heterologe Expression in Hefe zu charakterisieren. Zu diesem Zweck stand sowohl chemogenetisch definiertes als auch nicht definiertes Pflanzenmaterial zur Verfügung. Aus chemogenetisch definierten Linien von Matthiola incana konnte durch differentielle PCR ein komplementärer cDNA-Klon der F3'H, die vom Genlocus B kontrolliert wird, isoliert werden. In Enzymtests setzte das als CYP75B7 klassifizierte Enzym das 4'-hydroxylierte Naringenin (NAR) zu 3',4'-hydroxyliertem Eriodictyol (ERI) und das 4'-hydroxylierte Dihydrokaempferol (DHK) zu 3',4'-hydroxyliertem Dihydroquercetin (DHQ) um. Es konnte darüber hinaus durch Northernblot-Analyse eindeutig gezeigt werden, dass es sich bei den homozygot rezessiven Matthiola-Linien (bb) ohne F3'H-Aktivität um Trans-kriptions-Mutanten handelt. Zwei F3'H codierende cDNA-Sequenzen wurden aus einer cDNA-Genbank von Callistephus chinensis mit Hilfe einer F3'H cDNA-Sonde aus Arabidopsis thaliana isoliert. Bei der heterologen Expression des Klons CYPCcppHt1 zeigte das entsprechende Protein eine eindeutige F3',5'H-Aktivität, obwohl es aufgrund seiner Aminosäuresequenz nicht zu der Unterfamilie der F3',5'Hs CYP75A sondern in die Unterfamilie der F3'Hs CYP75B gehört. In den durchgeführten Enzymtests war das als CYP75B5 klassifizierte Enzym in der Lage NAR und DHK sowohl in 3'-Position als auch in 5'-Position zu hydroxylieren. Somit ist dies der erste Bericht über die Isolierung eines Enzyms mit einer F3'H spezifischen Aminosäuresequenz, das über eine F3',5'H-Aktivität verfügt. Bei der heterologen Expression des zweiten cDNA-Klons CYPCcpHt2 konnte bislang keine spezifische Enzymaktivität des codierten Enzyms, welches als CYP75B6 klassifiziert wurde, beobachtet werden. Eine weitere F3'H konnte aus Pelargonium zonale isoliert werden. Dabei wurde mit einem CYP-spezifischen Primer, der von der Hämbindungs-Region bekannter F3',5'H Sequenzen abgeleitet wurde, ein entsprechendes cDNA-Fragment durch PCR amplifiziert. Mit Hilfe des neuen RLM-RACE-Verfahrens konnte ein vollständiger cDNA-Klon generiert werden, der anschließend heterolog in Hefe exprimiert wurde. Sowohl in in vivo Enzymtests mit lebenden Hefezellen (Bioconversion) als auch in in vitro Enzymtests mit Hefemikrosomen setzte das als CYP75B8 klassifizierte Enzym NAR zu ERI und DHK zu DHQ um. Da die F3'H in Pflanzenextrakten von P. zonale aufgrund interferierender Inhaltsstoffe bisher nicht nachgewiesen werden konnte, ist dies der erste Nachweis der Existenz einer F3'H und des entsprechenden Gens in P. zonale. Durch den Einsatz des CYP-spezifischen Primers konnte außerdem ein F3',5'H-spezifisches cDNA-Fragment aus Lycianthes rantonnetii kloniert werden. Nach einem RLM-RACE wurde der offene Leserahmen des vollständigen Klons in Hefe exprimiert. Dabei zeigte das als CYP75A9 klassifizierte Enzym nur in den in vivo Enzymtests mit lebenden Hefen eine Enzymaktivität, aber nicht in Enzymtests mit Hefemikrosomen. Außerdem offenbarte das Enzym nur eine F3’H-Aktivität aber keine F3',5'H-Aktivität, so dass bislang nicht feststeht, ob es sich um eine F3'H oder um eine F3',5'H handelt . Durch die Klonierung und Charakterisierung der F3'H und der F3',5'H können viele neue und interessante Blütenfarben bei wirtschaftlich bedeutenden Zierpflanzen erzeugt werden. Darüber hinaus ermöglichen sie zusammen mit anderen Enzymen aus dem Flavonoidbiosyntheseweg die biotechnologische Produktion einer Vielzahl von verschiedenen Flavonoiden, die dadurch in ausreichender Menge und Reinheit der medizinischen Forschung und der Nahrungsmittelindustrie zur Verfügung gestellt werden können. Flavonoids are an important class of secondary metabolics present in all higher plants. Up to today more than 6400 different compounds are known. Anthocyanins, coloured flavonoids, represent the major pigments in flowers. They confer pink, red, mauve and blue to flowers and attract pollinators. Furthermore, Anthocyanins possess like all the other flavonoids various important properties for plants, such as protection against UV-B radiation and pests. The most prevalent Anthocyanins are characterized by the hydroxylation pattern of the B-ring of the basic flavonoid skeleton. The hydroxylation of the B-Ring is controlled by the activities of the two cytochrome P450 enzymes flavonoid 3'-hydroxylase (F3'H) and flavonoid 3',5'-hydroxylase (F3',5'H). Without the activity of one of these enzymes the 4'-hydroxylated Anthocyanin Pelargonidin is mainly generated which is responsible for many pink and orange flower colours. The activity of the F3'H predominantly leads to the production of the Cyanidin (3',4'-hydroxylated) and the activity of the F3',5'H predominantly leads to the production of delphinidin (3',4',5'-hydroxylated). Cyanidin gives flowers red and mauve colours, delphinidin is the main pigment in many blue flowers. The aim of this thesis was to isolate the F3'H and the F3',5'H by cloning of the corresponding genes from several plants and to characterize them by means of heterologous expression in yeast. For that purpose both chemogenetic defined and none defined plant material have been available. From chemogenetically defined lines of Matthiola incana a complementary cDNA clone of the F3'H that is controlled by the genetic locus B was isolated by means of differential PCR. In enzyme tests the enzyme classified as CYP75B7 converted the 4'-hydroxylated Naringenin (NAR) to 3',4'-hydroxylated Eriodictyol (ERI) and the 4'-hydroxylated Dihydrokaempferol (DHK) to 3',4'-hydroxylated Dihydroquercetin (DHQ). It could also clearly be shown through Northern blot analysis that the recessive lines of Matthiola (bb) without F3'H activity are transcription mutants. Two F3'H coding cDNA sequences were isolated from a cDNA library of Callistephus chinensis by using a F3'H cDNA labelled probe of Arabidopsis thaliana. During the heterologous expression of the clone CYPCcpHt1 the corresponding protein showed a definite F3',5'H activity even though it does not belong due to its amino acid sequence to the subfamily of the F3',5'Hs CYP75A but to the subfamily of the F3'Hs CYP75B. In the enzyme tests carried out the enzyme classified as CYP75B5 was able to hydroxylate NAR and DHK in the 3'-position as well as in the 5'-position. Thus, this is the first report on an isolation of an enzyme with a F3'H specific amino acid sequence which has a F3',5'H activity. Up to now the heterologous expression of the second clone CYPCcpHt2 has revealed no specific activity of the encoded enzyme which was classified as CYP75B6 . Another F3'H was isolated from Pelargonium zonale. For that purpose a corresponding fragment was amplified by PCR with a CYP-specific primer which derived from the heme-binding region of known F3',5'H sequences. By using the new RLM method a full-length cDNA clone could be generated and heterlogous expressed in yeast afterwards. In vivo enzyme tests (bioconversion) as well as in vitro enzyme tests showed the conversion of NAR to ERI and DHK to DHQ catalysed by the enzyme classified as CYP75B8. Since a F3'H activity could never be demonstrated in plant extracts of P. zonale due to interfering compounds this is the first evidence of the existence of a F3'H and of the corresponding gene in P. zonale. By using the same CYP-specific Primer a cDNA fragment from Lycianthes rantonnetii was also cloned by PCR. After a RLM-RACE the open reading frame of the full-length clone was expressed in yeast. The enzyme classified as CYP75A9 showed only a enzyme activity in the in vivo enzyme tests with living yeast, but not in enzyme tests with yeast microsomes. Additionally, the enzyme revealed only a F3'H activity, but no F3',5'H activity, so it is not certain at the moment whether this enzyme is a F3'H or a F3',5'H. Because of the cloning and characterization of the F3'H and the F3', 5'H many new and interesting flower colours can be created in economically important ornamental plants. Moreover, together with other enzymes of the flavonoid biosynthetic pathway they enable the biotechnological production of a multiplicity of different flavonoids, which can thereby be made available in sufficient quantity and purity for medical research and food industry.