In vitro Untersuchungen des zytotoxischen Effekts der alpha-emittierenden Nuklide 213Bi, 149Tb und 225Ac gekoppelt an monoklonale Antikörper und Bewertung der physikalischen und biologischen Eigenschaften der Nuklide und Antikörper

Abtötung einzelner Tumorzellen ist eine große therapeutische Herausforderung bei minimal residual disease und der disseminierten Ausbreitung von Tumorzellen in Körperhöhlen z.B. im Peritonealraum oder auf den Leptomenigen. Ein erfolgversprechender Ansatz dafür ist die Radioimmuntherapie, bei der radioaktive Nuklide mittels monoklonaler Antikörper gezielt an Tumorgewebe transportiert werden. Für die Radioimmuntherapie einsetzbar sind sowohl beta-Emitter als auch alpha-Emitter. Letztere haben sich als besonders effizient erwiesen, da bereits wenige Partikel ausreichen um Tumorzellen abzutöten. In dieser Arbeit wurden die alpha-Emitter 225Ac, 213Bi und 149Tb wahlweise an die monoklonalen Antikörper 6H8, HuM195 und 3F8 gekoppelt und die zytotoxische Wirkung der Radioimmunkonjugate an Zellkulturen quantifiziert und bewertet. 6H8 ist ein tumorspezifischer Antikörper, der an eine bestimmte Mutation des E-Cadherin (d9 E-Cad) bindet, die exklusiv beim diffusen Magenkarzinomen auftritt. HuM195 erkennt das tumorassoziierte Antigen CD33 auf Zellen der akuten myeloischen Leukämie. 3F8 ist ein Antigangliosid GD2 Antikörper, dessen Bindung an neuroektodermale Gewebe bei der Behandlung von Neuroblastomen zur Therapie genutzt wird. Die alpha-Partikel emittierenden Isotope 225Ac, 213Bi und 149Tb wurden mittels geeigneter Chelate an die Antikörper gekoppelt. Die Zytotoxizität der Radioimmunkonjugate gegenüber Zellen in Suspension, Zellpellets und Spheroiden wurde mittels 3H-Thymidininkorporierung, Tunel Assay, klonogenem Assay und Chromosomenaberrationen evaluiert. Die experimentellen Resultate bezüglich der Zytotoxizität von 213Bi-6H8 und 149Tb-6H8 gegenüber Zellsuspensionen wurde verglichen mit theoretisch ermittelten Ergebnissen, mit Hilfe eines Monte Carlo Algorithmus für Mikrodosimetrie. Die untersuchten Zelllinien unterschieden sich in ihrer Sensibilität gegenüber alpha-Partikeln sowie hinsichtlich des Auftretens von Apoptose. Um je 50% der Zellen einer Zelllinie mittels alpha-Emitter abzutöten (LD50) bedarf es für MDA Zellen einer 4,5 fach hohen Anzahl an alpha-Partikeln verglichen zu NMB7 und HL60 Zellen. Ein positiver Apoptosenachweis mittels Tunel Assay konnte jedoch nur für die HL60 Zellen geführt werden. Die zytotoxische Wirkung der alpha-Immunkonjugate erwies sich als abhängig von der Expression des entsprechenden Antigens, der Antigendichte auf der Zelloberfläche, der Affinität der verwendeten Antikörper zu den Antigenen, sowie der Rate der Internalisierung. So ändert sich der LD50-Wert der NMB7 Zellen durch die selektive Bindung des Radioimmunkonjugates 225Ac-3F8 an Zellen in Suspension von 30 Bq/ml auf 3,3 Bq/ml. Im Gegensatz dazu ist bei der Zelllinie MDA, die deutlich weniger Antigene exprimiert und diese auch fast nicht internalisieren, der LD50-Wert nach selektiver Bindung von 213Bi-6H8 an die Einzelzellen von 444 kBq/ml auf 130 kBq/ml gesunken. Nach Inkubation mit 740 kBq/ml 213Bi waren in 50% der MDA Zellen schwere Chromosomenaberrationen nachweisbar. Korrespondierend dazu lag bei 444 kBq/ml eine Verminderung der Proliferationsfähigkeit um 50% vor und bei 814 kBq eine Einschränkung der klonogenen Potenz der Zellen auf 50%. 149Tb-6H8 und 213Bi-6H8 zeigten trotz unterschiedlicher Partikelenergien (4 MeV versus 8 MeV) ähnliche Zytotoxizität gegenüber Zellsuspensionen. Gegenüber Zellpellets und Spheroiden dagegen zeigte nur 213Bi-6H8 einen starken zytotoxischen Effekt, aufgrund eines ausgeprägten Crossfire-Effekts. Die mikrodosimetrische Simulation der Experimente an Zellsuspension war in guter Übereinstimmung mit der experimentell ermittelten Zytotoxizität. Nur für 213Bi wurde eine im Vergleich zum Experiment etwas höhere Zytotoxizität berechnet. Die Erhöhung der Zytotoxizität der alpha-Immunkonjugate im Zellmodell durch selektive Bindung ist für die therapeutische Anwendung ein sehr vielversprechendes Ergebnis. Vor einer klinischen Untersuchung können weitere Einflussgrößen, die die Auswahl der Nuklide und der Antikörper bestimmen im Tierexperiment evaluiert werden und an individuellen Tumorzellen Antigendichte, Internalisierung und Sensibilität gegenüber alpha-Emittern bestimmt werden. Aber erst in klinischen Studien werden sich eventuelle Überlegenheiten der alpha-Radioimmuntherapie gegenüber etablierten Therapien endgültig beweisen lassen. Treatment of minimal residual disease and loco-regional dissemination or tumors is a challenge in the course of most cancers. One promising treatment approach is radioimmunotherapy utilizing alpha emitting nuclides. Alpha emitting nuclides possess the advantage of very short range in tissue and a high linear energy transfer leading to selective damage at the site of decay. In this study the alpha emitting isotopes Ac-225, Bi-213 and Tb-149 were coupled to the monoclonal antibodies 6H8, HuM195 and 3F8. 6H8 binds to d9 mutated E-cadherin expressed in 10% of diffuse type gastric cancer, HuM195 is binding to CD33, found on 90% of acute myeloic leukemias and 3F8 is an anti-ganglioside GD2 antibody binding to some tumors of neuroendocrine origin. Cytotoxicity of these alpha immunoconjugates towards cells in suspension, cell pellets and tumor cell spheroids were investigated using H-3-Thymidine incorporation, Tunel Assay, clonogenic assay and chromosomal aberration assay. In addition the experimental findings were compared to microdosimetric predictions calculated by a Monte Carlo algorithm. Radiosensitivity of the investigated tumor cell lines after alpha irradiation varied by a factor of up to 4.5 and only HL60 leukemia cells died by apoptosis. Also antibody affinity, antigen expression and rate of internalisation played major roles in determination of the cytotoxic effect caused by the alpha immunoconjugates. For example, LD50 values - after incubation with Ac-225-3F8 - of NMB7 neuroblastoma cells, displaying approx. 5 million internalising binding sites changed from 3,3 Bq/ml to 30 Bq/ml when binding sites were blocked by excess unlabeled 3F8. Incubation with 740 kBq/ml Bi-213-6H8 caused in 50% of MDA breast cancer cells multiple and heavy chromosomal aberrations. In analogy, proliferation capacity was reduced to 50% by 444 kBq/ml and clonogenic capacity of 50% was caused by 814 kBq/ml. Tb-149-6H8 and Bi-213-6H8 showed - despite different particle energies (4 MeV and 8 MeV) - identical cytotoxicity in cell suspensions. In contrast, in cell clusters only Bi-213-6H8 was able to cause preferential cell killing of binding site expressing cell pellets or spheroids. Theoretical calculations matched these findings with reasonable accuracy. Thus the potency of alpha immunoconjugates could be shown on single cell and small tumor cell cluster state and further in vivo or clinical studies will determine eventual benefits of alpha immunotherapy in cancer treatment.