Integrin alpha6beta4 and Protein Kinase C in Epidermal Differentiation and Skin Carcinogenesis

Schlüsselereignisse bei der epidermalen Differenzierung sind das Ablösen der Basalzellen von der Basalmembran und ihre Aufwärtswanderung synchron zur terminalen Differenzierung mit dem Endstadium der Hornschuppen, die die äußerste Barriere bilden. Zellrezeptoren, die bei der Auslösung dieses Prozesses eine wichtige Rolle spielen, sind die Integrine, die einen erheblichen Anteil an der Gewebeorganisation haben. Andererseits sind Integrine auch maßgeblich an der zellulären Signaltransduktion beteiligt. Als Hauptkomponente der Hemidesmososmen, die die Basalzellen mit der darunter liegenden Basalmembran verbinden, kommt Integrin alpha6beta4 eine herausragende Funktion zu. Über seine cytoplasmatischen Domänen interagiert alpha6beta4 mit PKCalpha und PKCdelta, und wird dabei seinerseits modifiziert. Grundlegende Änderungen in der Integrin-Expression und -Verteilung werden bei der Tumorigenese beobachtet. Auffallend bei Hautcarcinomen sind vor allem die Dislokation und Überexpression von Integrin alpha6beta4, was weitreichende Konsequenzen für die PKC-Signaltransduktion hat. Ziel dieser Arbeit war daher die Analyse der Rolle von PKCalpha, PKCdelta und Integrin alpha6beta4 in Keratinozyten und deren mögliche Bedeutung bei der Tumorentstehung. Dabei sollte die Funktion von PKCalpha, PKCdelta und Integrin alpha6beta4 bei der Regulation von Zell-Matrix-Interaktionen, Migration und Differenzierung untersucht werden. Hierfür wurden normale humane primäre Keratinozyten und die humane Keratinozyten-Zell-Linie HaCaT, eine immortale „prämaligne“ Zelle, mit adenoviralen Konstrukten für PKCalpha, PKCdelta, für die Integrin alpha6-Kette und für beta-Gal als Negativkontrolle infiziert. Reproduzierbare Infektionen mit hohen Infektionseffizienzen und die langsam abnehmende Synthese der exogenen Proteine erlaubten funktionelle Analysen in zweidimensionalen Kulturen, als auch in der komplexeren, physiologischen, dreidimensionalen organotypischen Kokultur (OTK). In zweidimensionalen Kulturen erhöhte PKCdelta die Migrationsaktivität der Zellen, vermutlich durch reduzierte Adhäsion an Laminin-5. Erhöhte Integrin alpha6 Level dagegen veränderten das Wachstumsverhalten dramatisch, was schließlich zu einem massiven Absterben der Zellen führte. Daher entwickelten sich in OTKs von alpha6 Zellen nur atrophische Epithelien. Differenzierungsmarker konnten, wahrscheinlich aufgrund der verminderten Lebenszeit der Zellen, nicht detektiert werden. Das Fehlen einer kompensierenden Hochregulation der Integrin beta4-Kette, die in überlebenden Maus-Keratinozyten beobachtet wurde, wird als Ursache für den Zelltod im humanen System angesehen. HaCaT-Zellen sind im Allgemeinen in der Lage ein Epithel vergleichbar der Epidermis zu bilden, obwohl sie bestimmte Differenzierungs-Defizite zeigen. So verläuft die Entwicklung stratifizierter Epithelien langsamer als bei normalen Keratinozyten und ist charakterisiert durch das Vorhandensein eines parakeratotischen Stratum corneums, was auf eine unvollständige Differenzierung hinweist. PKCalpha und PKCdelta überexprimierende Zellen dagegen bildeten gut differenzierte Epithelien, die denen normaler Keratinozyten ähnelten. Differenzierungsmarker und Basalmembrankomponenten wurden regulär exprimiert. Bei normalen Keratinozyten hatte die adenovirale Überexpression der PKC Isoformen keinen stimulierenden Einfluss auf Epithelwachstum und Stratifizierung. Die Überexpression der beiden PKC-Isoformen schien somit die bei HaCaT veränderte bzw. nicht ausreichende Interaktion mit Fibroblasten zu verbessern, was letztendlich zu einer normalisierten Differenzierung und Stratifizierung führte. One key event in epidermal differentiation is the detachment and upward movement of basal cells upon their commitment. Cell receptors playing a major role in this process are integrins which provide spatial organization and participate in signaling events. Among those integrin alpha6beta4 is a key component of epidermal attachment devices to the basement membrane, the hemidesmosomes. These connect the proliferative basal cell layer with the underlying basement membrane. By its cytoplasmic integrin tails alpha6beta4 interacts with PKCalpha and PKCdelta, thereby getting itself modified. Profound changes in integrin expression and tissue distribution occur during tumorigenesis. Most striking in skin carcinomas are dislocation and dramatic expansion of alpha6beta4 which coincides with anomalies in PKC signaling. This project was devoted to functional links of PKCalpha, PKCdelta, and alpha6beta4 integrin in regulation of cell-matrix interactions, migration, and differentiation which also concerns respective defaults in neoplasia such as loss of tissue polarity. Thus, normal human keratinocytes (NHK) and the derived line HaCaT (clone 6) were infected with adenoviral constructs for PKCalpha, PKCdelta, integrin alpha6 chain, or beta-gal as control. Reproducible infections, high efficiency rates, and slowly declining synthesis of exogenous proteins allowed functional tests in 2D-cultures, but also in the more complex, physiological 3D-organotypic cocultures. In 2D-cultures PKCdelta enhanced closure of scratch wounds, presumably by reducing adhesion to epidermal laminin-5. Contrasting mouse data, elevated integrin alpha6 levels altered the growth behavior, causing massive cell death eventually. Thus, in 3D-cocultures of alpha6-cells only poorly stratified, atrophic epithelia developed and no differentiation markers were detectable apparently due to the reduced lifespan. The lack of compensatory up-regulation of the integrin beta4 chain, occurring in the surviving mouse cells, is considered to cause cell death in the human system. HaCaT cells in general are able to produce a nearly epidermis-like epithelium, although they display certain defficiencies in differentiation depending on environmental conditions. Thus, compared to normal keratinocytes the development of stratified epithelia occurs more slowly and is characterized by a parakeratotic stratum corneum, indicating uncomplete differentiation. PKCalpha and PKCdelta over-expressing cells, however, gave rise to normal, well differentiated epithelia that resembled more closely those of NHK. Stratification was improved and parakeratosis reduced. All differentiation markers as well as components of the basement membrane zone were regularly expressed. Normal human keratinocytes, revealing no differentiation defficiencies in 3D-coculture, did not behave differently upon adenoviral infection. Thus, PKC-mediated improved interactions between HaCaT cells and dermal fibroblasts, being otherwise weakened, may be considered to induce epithelial normalization.