Neue Marker für prospektive Isolierung und Charakterisierung von Stromazellen, Endothelzellen und Spermatogonien, Vorläuferzellen aus adulten menschlichen Hoden

The isolation of spermatogonia from adult human testis is hampered by the limited selectivity of available markers. In this study, I evaluated the suitability of combinations of known markers and novel targets for the prospective isolation of spermatogonia from adult human testis. Immunohistochemical studies, multicolor staining and cell sorting of testis samples followed by multiplex PCR and dendrogram cluster analysis revealed that spermatogonia were enriched at high purity in the CD49f+CD49a-SSEA-4+SUSD2+ population as well as in the CD49f+CD49a-SSEA-4+/-CD164+ subsets. In contrast to spermatogonia, testicular stromal cells and testicular endothelial cells were found to be highly enriched in the CD49f+CD49a+CD144- and in the CD49f+CD49a+CD144+ subsets, respectively. The delineation was confirmed by the expression of specific stromal and endothelial key markers as well as by the differentiation capacity of each subset. In addition, I identified for the first time two distinct subsets of spermatogonia, distinguished by their CD49f+SSEA-4+CD164+ and CD49f+SSEA-4-CD164+ expression profiles. Multiplex PCR analysis revealed that cells of the CD49f+SSEA-4-CD164+ subset express spermatogonia/germ cell specific markers, whereas the CD49f+SSEA-4+CD164+ subset is enriched in undifferentiated spermatogonia specific markers. The knowledge about the composite phenotype of defined testicular cell subsets and the reliable isolation procedure may contribute to the precise characterization and efficient isolation of spermatogonia from small biopsies and may contribute to the treatment of infertility. Die Isolierung von Spermatogonien aus adulten menschlichen Hoden ist zur Zeit wegen der begrenzten Zahl und dem Mangel an selektiven Markern nur eingeschränkt möglich. In der vorliegenden Arbeit wurden Kombinationen bekannter Marker und neuer Targets, die für die Isolierung von Spermatogonien geeignet sind, untersucht. Mit Hilfe immunhistochemischer Analysen, Mehrfarbenfluoreszenzanalysen und Zellsortierung von Proben aus Hodengewebe sowie nachfolgenden Multiplex-PCR und Dendrogramm Clusteranalysen konnte gezeigt werden, dass Spermatogonien sowohl in der CD49f+CD49a-SSEA-4+SUSD2+ Population als auch im CD49f+CD49a-SSEA-4+/-CD164+ Subset hochrein isoliert werden können. Außer Spermatogonien konnten aus Hodengewebe auch Stromazellen in der CD49f+CD49a+CD144- Population und Endothelzellen im CD49f+CD49a+CD144+ Subset isoliert werden. Die Unterscheidung von Endothelzellen und Stromazellen wurde über den Nachweis der spezifischen Expression von Schlüsselmarkern sowie durch die unterschiedliche Differenzierungkapazität der jeweiligen Zellpopulationen erzielt. Darüber hinaus konnten zum ersten Mal zwei unterschiedliche Populationen von Spermatogonien identifiziert werden, die sich durch ihre differenziellen Expressionsprofile unterscheiden. So konnte über Multiplex PCR-Analysen gezeigt werden, dass CD49f+SSEA-4-CD164+ Zellen Keimzell-spezifische Marker exprimierten, die einem differenzierteren Stadium von Spermatogonien entsprechen, während Zellen im CD49f+SSEA-4+CD164+ Subset Marker exprimierten, die typischerweise bei Spermatogonien im undifferenzierten Stadium vorkommen. Die Kenntnis des genauen Phänotyps von Spermatogonien sowie die hochreine Isolierung dieser seltenen Zellpopulation ist möglicherweise ein wichtiger Baustein bei der Behandlung von Unfruchtbarkeit.