Study of APE1/Ref-1 expression in human hepatocellular carcinoma. Evaluation of its prognostic significance

2007/2008 ABSTRACT: Human Hepatocellular Carcinoma (HCC) is the fifth most frequent neoplasm worldwide and its incidence is rising in Western countries. HCC is frequently diagnosed at advanced stage and, until today, there are no effective treatments of this late phase. Therefore, research focused on finding new markers of progression and new molecular targets for therapy for HCC is of the utmost importance. Unquestionably, HCC is the most serious complication of long-standing chronic disease representing generally the final event of a liver disease usually originated decades earlier. Any chronic liver disease that causes cirrhosis is considered a risk factor for HCC development and this disease is characterized by chronic inflammation involving repeated rounds of necrosis and regeneration associated with sustained oxidative stress. Apurinic apyrimidinic endonuclease/redox effector factor 1 (APE1/Ref-1) is a multifunctional protein involved in redox regulation of transcription factors and acting as an endonuclease of the base excision repair (BER) pathway of DNA lesions. APE1/Ref-1 has been found to be up-regulated and abnormally localized in the cytoplasmic compartment of several cancer cells. Of notice is the finding that cytoplasmic localization is associated with a poor prognosis. Since at the time I started my thesis no data were available about the possible involvement of APE1/Ref-1 in HCC, the aim of this work was to investigate the expression and sub-cellular localization of APE1/Ref-1 in HCC. In addition, my aim was also to analyze the correlation of these parameters with the progression of the disease. To accomplish these points I analyzed human samples of HCC and cirrhosis (in vivo model) and an in vitro model constituted by HCC cell lines at different degree of differentiation. I also assessed the protective role of APE1/Ref-1 to oxidative damage as a function of its sub-cellular localization over-expressing, in normal hepatocytes, wild type and mutated forms of the protein that force its distribution to different cellular compartments. Using these approaches, we found that HCC is characterized by increased APE1/Ref-1 mRNA and protein levels and, that this up-regulation increases accordingly with tumor differentiation grading showing an association between tumor progression and APE1/Ref-1 levels. The increased amount of APE1/Ref-1 induces its nuclear and cytoplasmic accumulation in HCC. The cytoplasmic localization is peculiar of HCC and more frequently observed in poorly-differentiated cancers. The fact that APE1/Ref-1 accumulates in the cytoplasm of poorly-differentiated tumors and correlates with a shorter survival time after HCC resection points to a possible role of the APE1/Ref-1 sub-cellular localization as a prognostic marker of HCC aggressiveness. Thereafter, I demonstrated that APE1/Ref-1 over-expression in the normal hepatocyte cell line (IHH) enhances survival after oxidative damage induced by exposure to H2O2 and UV radiation although the different forms of the protein behave in a different ways. Wild type and truncated forms of APE1/Ref-1, that localize mainly in the cytoplasm and mitochondria, confer protection to H2O2 damage while the non-cleavable form, localized in the nucleus, does not. Conversely, all the mutants protect IHH from UV induced apoptosis. These data demonstrate for the first time that APE1/Ref-1 expression is deregulated in HCC, that its over-expression has a protective role in vitro and that APE1/Ref-1 cytoplasmic localization has a prognostic significance in vivo. We favor the conclusion that APE1/Ref-1 may be considered as a new prognostic marker for HCC aggressiveness. Its possible involvement in HCC development offer a new molecular key to elucidate the role of this protein in oxidative stress related hepatocarcinogenesis. RIASSUNTO: Il carcinoma primitivo del fegato è la quinta neoplasia più frequente al mondo e rappresenta la terza causa di morte per cancro. La sua incidenza negli ultimi anni è significativamente aumentata nei paesi occidentali e, nonostante i miglioramenti delle metodiche diagnostiche, la diagnosi di epatocarcinoma è spesso effettuata solo nella fase avanzata di malattia quando, le terapie al momento disponibili sono esclusivamente palliative. L’incremento di nuovi casi e la mancanza di terapia medica efficace, sottolineano la necessità di individuare nuovi marcatori prognostici e nuovi target terapeutici. Dal punto di vista fisiopatologico, il carcinoma epatocellulare rappresenta la complicanza più grave di una malattia cronica di fegato, generalmente iniziata molti anni prima della diagnosi di HCC, evoluta in cirrosi. La cirrosi epatica si sviluppa come conseguenza di un flogosi cronica che causa, cicli di necrosi e rigenerazione con un danno epatocitario sostenuto dallo stress ossidativo ed è considerata il fattore di rischio principale per lo sviluppo di HCC. APE1/Ref-1 (Apurinic apyrimidinic endonuclease/redox effector factor 1) è una proteina coinvolta nella regolazione dello stato redox cellular e agisce come co-attivatore di fattori trascrizionali e nel meccanismo BER (base excission repair) di riparo dei danni ossidativi al DNA. In molti tumori è stato dimostrata una up-regolazione di APE1/Ref-1 e in diversi casi la localizzazione citoplasmatica della proteina si è dimostrata correlare con una cattiva prognosi. Nel momento in cui ho cominciato il lavoro di tesi non era disponibile alcun dato sul possibile coinvolgimento di una alterata espressione di APE1/Ref-1 nel carcinoma primitivo del fegato. Gli obbiettivi di questa tesi sono stati, pertanto, la valutazione dell’espressione e del pattern di localizzazione cellulare di APE1/Ref-1 nel HCC in correlazione alla progressione della malattia e alla prognosi. In questa ottica ho valutato sia campioni di pazienti, diagnosticati affetti da HCC su cirrosi e trattati chirurgicamente, che un modello in vitro di epatocarcinoma a diversi gradi di differenziazione. Un ulteriore obbiettivo è stato quello di valutare l’eventuale effetto protettivo della overespressione di APE1/Ref-1 in una linea cellulare derivata da epatociti umani da fegato sano. In questo caso sono state overespresse differenti forme della proteina in modo da valutare il ruolo protettivo in relazione alle diverse localizzazioni intracellulari. Sulla base di questi modelli noi abbiamo osservato che l’epatocarcinoma è caratterizzato da un incremento dei livelli di mRNA e proteina di APE1/Ref-1 che cresce in modo inversamente proporzionale rispetto al grado di differenziazione del cancro. L’aumentata produzione della proteina si associa ad un accumulo della stessa sia nei nuclei che nei citoplasmi di HCC con livelli maggiori rispetto alla SLC, la localizzazione citoplasmatica nel tessuto tumorale si è dimostrata peculiare del cancro e più frequente negli HCC poco differenziati. L’osservazione che associa la maggiore frequenza della localizzazione citoplasmatica nei tumori poco differenziati e la correlazione di tale localizzazione con una ridotta sopravvivenza individua in APE1/Ref-1 un marker di aggressività di HCC. I dati ottenuti hanno inoltre dimostrato che la overespressione di APE1/Ref-1, seppur con peculiarità legate alle diverse forme, conferisce alle IHH una resistenza allo stress ossidativo indotto da H2O2 e radiazioni UV. La forma wild type e la forma tronca della proteina, che localizzano nel citoplasma, proteggono le cellule dal danno da H2O2, mentre la forma non clivabile, a localizzazione nucleare, non conferisce la stessa protezione. Per quanto riguarda invece il danno indotto da UV tutte le forme della proteina sono in grado di proteggere le cellule epatiche dall’apoptosi. Tutti questi dati dimostrano per la prima volta che l’espressione di APE1/Ref-1 è deregolata nel carcinoma epatocelluare e che la sua overespressione ha un ruolo protettivo in vitro. La localizzazione citoplasmatica nel tessuto tumorale della proteina ha significato prognostico. Pertanto, APE1/Ref-1 può essere considerato come un possibile nuovo marker prognostico di aggressività dell’epatocarcinoma. Il suo possibile coinvolgimento nello sviluppo di HCC apre nuove possibili strade nella comprensione del ruolo di questa proteina nei meccanismi che associano lo stress ossidativo all’epatocarcinogenesi.