Use of bio-waste for polyhydroxyalkanoates (PHA) biosynthesis: enhanced accumulation towards a sustainable and economical bioprocess

Polyhydroxyalkanoates (PHA) are considered a promising alternative to oil-based plas- tics. They are naturally occurring polyesters, biocompatible and biodegradable into CO2 and H2O. Nowadays, PHA are produced through a costly process using single cultures at full-scale, which has prevented the widespread use of this plastics for cheaper applications. An alternative bioprocess with mixed microbial cultures (MMC) has been considered as an alternative approach using wastes as feedstock. This process generally consists of acido- genic fermentation of a waste, selection of a PHA-accumulating culture and PHA accumulation. This thesis has mostly focused in the last two steps, particularly on overcoming the complexity of fermented wastes by valorizing them into PHA with a focus pilot-scale experiments. In the first experimental study, the typical 3-stage process was setup at pilot scale. A caproate-rich fermentate was produced from fruit waste and used in the subsequent stages to produce a 3-hydroxyhexanoate-rich PHA, containing up to 66% (wt.) of this medium chain length (mcl) monomer. The metabolism of caproate was further elucidated and a metabolic pathway to produce this mcl monomer was proposed. A second study was carried out using a nitrogen-rich fermented food waste as substrate for bench-scale and pilot-scale PHA processes, which resulted in the production of a 3-hy- droxyoctanoate-containing tetra-polymer. A mass balance was performed to understand the fermentation products' metabolism and a projection to latent structures (PLS) model was cre- ated to predict PHA production. In the third study, ammonia was stripped out from fermented sewage sludge and fed to a bench-scale selection reactor during the famine phase as nitrogen source in a partially un- coupled carbon and nitrogen feeding strategy. This additional step resulted in an increase in 77% of productivity compared to similar operating conditions without nitrogen removal be- forehand. The impact of using a nitrogen-rich fermented food waste as nitrogen source in the fam- ine phase, while a fermented fruit waste was used as carbon source in the feast phase was evaluated in the fourth study. Although a slight decrease in PHA content and productivity was observed, the change in operating conditions allowed the use of a low-cost waste instead of a supplementation of nutrients. This Thesis demonstrates how to overcome process challenges through process adapta- tions to produce an added-value product from highly abundant wastes. Polihidroxialcanoatos (PHA) são considerados uma alternativa promissora aos plásticos derivados do petróleo. Os PHA são poliésteres naturais, biocompatíveis e biodegradáveis em CO2 e H2O. Hoje em dia, os PHA são produzidos através de um processo caro usando culturas puras à escala industrial, o que tem impedido um uso mais abrangente destes plásticos em aplicações de baixo custo. Um bioprocesso alternativo usando culturas microbianas mistas (MMC) tem sido consi- derado com alternativa usando resíduos como substratos. Este processo consiste geralmente na fermentação acidogénica do resíduo, seleção da cultura bacteriana acumuladora de PHA e a produção de PHA. Esta tese foca-se nos últimos dois passos, particularmente em ultrapassar as barreiras que os resíduos fermentados possuem, valorizando-os a PHA em experiências à escala piloto. No primeiro estudo experimental, o processo convencional de três passos foi implemen- tado à escala piloto. Um efluente rico em caproato foi produzido a partir de resíduo de fruta e usado nos passos subsequentes para produzir um PHA rico em 3-hidroxihexanoato, contendo até 66% (wt.) deste monómero de cadeia média (mcl). O metabolismo do caproato foi eluci- dado e a via metabólica da produção deste monómero mcl foi proposta. Um segundo estudo foi conduzido usando resíduo de comida rico em azoto como subs- trato em processos de escala laboratorial e piloto e que resultou na produção de um tetra polímero de PHA que continha 3-hidroxioctanoato. Um balanço de massa foi feito de forma a compreender o metabolismo dos produtos de fermentação e um criou-se um modelo de pro- jeção das estruturas latentes (PLS) para prever a produção de PHA. No terceiro estudo, a amónia foi removida de lamas de esgoto fermentadas e alimentada durante a fase de fome como fonte de azoto numa estratégia de alimentação de carbono e azoto desacoplada. Este passo adicional resultou num aumento de produtividade em 77% comparativamente a condições de operação similares sem o passo de remoção de azoto. O impacto do uso de um resíduo de comida rico em azoto como fonte de azoto na fase de fome, enquanto um resíduo de fruta fermentada foi usado como fonte de carbono na fase de fartura foi estudado no quarto estudo. Apesar do pequeno decréscimo no conteúdo final de PHA e produtividade, a mudança de condições de operação permitiu o uso de um resíduo fermentado de baixo custo como alternativa à suplementação de nutrientes. Esta tese demonstra como ultrapassar desafios de processo através de adaptações ao processo tradicional de forma a produzir um produto de valor acrescimento a partir de resí- duos abundantes.