Apoplastic ROS and transcriptional response in plant stress signaling

The air pollutant ozone (O3) enters plant leaves through stomata and activates apolastic reactive oxygen species (ROS) signaling. Depending on growth conditions and genotype, this results in large transcriptional reprogramming,closure of stomatal pores and activation of cell death programs. These responses are also regulated through plant stress hormones. This thesis sheds light on how stress hormone signaling is connected with apoplastic ROS signaling in the model plant Arabidopsis thaliana, and investigates regulatory mechanisms which generate specificity among sequence-specific transcription factors (TFs), the executers of apoplastic ROS -induced transcriptional reprogramming. The essential methods of the thesis include O3 exposures of Arabidopsis wild type and mutant plants followed by quantification of cell death and characterization of transcriptional responses supplemented with several protein-level analyses of selected WRKY family TFs. The O3-induced cell death was found to be inhibited by plant hormone salicylic acid, and genes RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG F (RBOHF) and WRKY70 were found to be required for O3-induced cell death in jasmonic acid insensitive genetic background. Even though stress hormones were verified to play important roles in the regulation of cell death, the transcriptional response to apoplastic ROS in a hormone deficient/insensitive mutant was highly similar to wild type, suggesting that much of the signaling involved is independent of the studied hormones jasmonic acid, salicylic acid, and ethylene. The potential major executers of transcriptional response to apoplastic ROS, WRKY family TFs, were studied for their transcriptional regulation, DNA-binding preferences, protein-protein interactions, subcellular localization, and effects on transcriptome. The results showed that the DNA-binding preferences of WRKYs vary substantially between phylogenetic groups, implying that the specificity in signaling between different WRKYs can be partly achieved through DNA binding preferences. Transcriptomic analyses of mutants with altered expression levels of the strongly ROS-inducible WRKY75 implicate this TF as a positive regulator of well-known pathogen-responsive genes, such as PATHOGENESIS-RELATED GENE 1 (PR1) and PATHOGENESIS-RELATED GENE 2 (PR2), and as a negative regulator of several hormone signaling pathways and TFs. Ilmansaaste otsoni tunkeutuu kasvin lehteen ilmaraoista ja käynnistää siellä reaktiivisiin happilajeihin perustuvan viestintäketjun. Kasvuoloista ja perimästä riippuen tämä viestintä voi johtaa ilmarakojen sulkeutumiseen, ohjelmoidun solukuoleman käynnistymiseen ja suuriin muutoksiin geenien ilmentymisessä. Reaktiivisten happilajien lisäksi näitä vasteita säädellään kasvihormonien välityksellä. Tämä väitöstyö valaisee kasvin stressihormoniviestinnän ja reaktiivisiin happilajeihin perustuvan viestinnän yhteyksiä lituruohossa (Arabidopsis thaliana) ja tutkii, mitkä mekanismit luovat spesifisyyttä niiden geenien ilmentymisen säätelytekijöiden välille, jotka suurelta osin vastaavat reaktiivisten happilajien aiheuttamista muutoksista geenien ilmentymisessä. Väitöstyön keskeisiä menetelmiä ovat lituruohon sekä lituruohomutanttien otsonikäsittelyt ja niiden aiheuttaman ohjelmoidun solukuoleman mittaaminen. Lisäksi tutkittiin otsonikäsittelyn aiheuttamia muutoksia geenien ilmentymisessä sekä proteiinitason muutoksia WRKY-perheen säätelytekijöissä. Kasvihormoni salisyylihapon havaittiin estävän otsonin käynnistämää solukuolemaa lituruohossa. Lisäksi havaittiin, että geenit RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG F (RBOHF) ja WRKY70 vaaditaan otsonin käynnistämän ohjelmoidun solukuoleman toteuttamiseksi otsoniherkässä liturohomutantissa, joka on kykenemätön aistimaan kasvihormoni jasmiinihappoa. Vaikka stressihormonien keskeinen rooli solukuoleman säätelyssä vahvistettiinkin, muutokset geenien ilmentymisessä vasteena reaktiivisiin happilajeihin olivat yllättävän samanlaisia lituruohossa ja lituruohomutantissa, jolta puuttui kyky valmistaa/aistia keskeisiä stressihormoneja jasmiinihappoa, salisyylihappoa ja etyleeniä. Tulos antaa ymmärtää, että suuri osa geenien ilmentymisen muutoksiin johtavasta viestinnästä vasteena reaktiivisiin happilajeihin kulkee reittejä, jotka eivät vaadi kyseisiä hormoneja toimiakseen. WRKY-perheen säätelytekijät ovat keskeisessä osassa apoplastin reaktiivisten happilajien aiheuttamassa geenien ilmentymisen muutoksessa. Väitöstutkimuksessa WRKYjä tutkittiin geenisäätelyn, DNA-sitoutumistaipumusten, proteiini-proteiinivuorovaikutusten ja solunsisäisen jakautumisen suhteen. Tulos, jonka mukaan DNA-sitoutumistaipumukset erosivat merkittävästi fylogeneettisten alaryhmien välillä, viittaa siihen, että viestinvälityksen spesifisyys WRKY-perheen jäsenten välillä saavutetaan ainakin osittain DNA-sitoutumisen tasolla.