Caracterización de cepas de Klebsiella pneumoniae resistentes a carbapenems

Introducción: Klebsiella pneumoniae es un importante patógeno humano, tanto en el ambiente hospitalario como en la comunidad. Coloniza las mucosas y la piel de pacientes hospitalizados, causando sobre todo infecciones del tracto respiratorio y del tracto urinario. En personas con comorbilidades se comporta como un patógeno oportunista, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. La rápida expansión de la resistencia a antibióticos carbapenémicos en K. pneumoniae, considerados antimicrobianos de última línea, se atribuye a la adquisición de enzimas con capacidad para hidrolizar estos antibióticos. Además, esta diseminación se ve facilitada por la existencia de elementos genéticos móviles que pueden transferirse de forma horizontal dentro de la misma especie. Por este motivo, tras la creciente alarma por el aumento de cepas de K. pneumoniae resistentes a carbapenémicos y sus preocupantes consecuencias para la Salud Pública decidimos realizar un estudio en nuestra área para caracterizar las cepas de K. pneumoniae en las que se detectara resistencia a dichos antimicrobianos. Por otro lado, con el desarrollo de las nuevas tecnologías de secuenciación masiva y su reciente aplicación a la Microbiología Clínica, se está obteniendo información precisa sobre los genes relacionados con la resistencia antimicrobiana, así como sobre los elementos genéticos móviles en los que se encuentran dichos genes. Además, también pueden identificarse genes de virulencia y llevarse a cabo estudios epidemiológicos para la caracterización de brotes. Esta novedosa técnica se ha utilizado en esta tesis doctoral para obtener una comprensión más profunda de las características genéticas de los microorganismos estudiados, así como para realizar una comparación con los métodos “clásicos” hasta ahora disponibles en los laboratorios de Microbiología Clínica. Objetivos: El objetivo principal de la tesis doctoral ha sido caracterizar las cepas de K. pneumoniae resistentes a carbapenems aisladas durante los años 2015-2018 en el Consorcio Hospital General Universitario de Valencia. Como objetivos secundarios, también se ha llevado a cabo: 1. Descripción de las características clínico-demográficas de los pacientes con aislamientos de K. pneumoniae resistentes a carbapenémicos y análisis de posibles factores de riesgo relacionados con dichos aislamientos. 2. Estudio del perfil de sensibilidad de las cepas y caracterización fenotípica y genotípica de mecanismos de resistencia antibiótica. 3. Análisis de elementos genéticos móviles relacionados con la diseminación de resistencias. 4. Determinación de factores de virulencia. 5. Análisis e investigación de brotes nosocomiales. Metodología: Se llevó a cabo un estudio retrospectivo desde enero del año 2015 hasta diciembre del año 2018, ambos inclusive, en el Servicio de Microbiología del Consorcio Hospital General Universitario de Valencia (CHGUV), incluyendo todas las cepas de K. pneumoniae resistente a carbapenémicos (KPRC). Se recopilaron datos clínicos y demográficos de los pacientes infectados y/o colonizados por KPRC a partir del sistema informático del laboratorio (GestLab) y de las historias clínicas electrónicas consultando el programa Hospital General Intranet. Todos los datos se registraron en una base de datos Excel para su posterior estudio y análisis estadístico. El único criterio de inclusión para el estudio fue el aislamiento de KPRC. Los datos recogidos de cada paciente fueron los siguientes: Sala de hospitalización (únicamente el episodio en el que se aísla la KPRC incluida en el estudio); Hospitalización previa (< 6 meses); Tipo de infección (en caso de producirse); Asociada a la asistencia sanitaria (IRAS): aparición de la infección tras al menos 48 horas de hospitalización o durante los 30 días posteriores a la asistencia sanitaria; Infección adquirida en la comunidad; antibioterapia reciente (< 30 días); diabetes mellitus; insuficiencia renal crónica; cirrosis; enfermedad pulmonar crónica; uropatología funcional o estructural; catéter urinario; colonización previa (faríngea o axilo-rectal); neumonía (asociada o no a ventilación mecánica); cirugía o complicaciones derivadas de la misma (< 30 días). Para el análisis estadístico, se realizó un análisis univariado de todas las variables: factores de riesgo para desarrollar infección y/o colonización por KPRC. Se calcularon los Odds ratio (OR) y los intervalos de confianza (IC) del 95% utilizando el software en línea MedCalc. En este estudio se incluyó únicamente una cepa de KPRC por paciente, habitualmente el primer aislamiento, excepto en aquellos casos en los que dicha cepa no se encontrara disponible. Los aislamientos de K. pneumoniae procedentes de muestras clínicas y/o muestras de vigilancia activa durante los años 2015 a 2018 se identificaron mediante pruebas bioquímicas con el método automatizado MicroScan® (Beckman Coulter) con los paneles NUC69 y NC70, en función del tipo de muestra (NUC69 orinas y NC70 resto de muestras). Este método combina diferentes pruebas bioquímicas y enzimáticas para la identificación de los microorganismos, junto con concentraciones críticas de antibióticos para determinar la concentración mínima inhibitoria (μg/ ml) (CMI) de los distintos antibióticos frente a los microorganismos. Para la interpretación categórica de sensibilidad antibiótica se siguieron los puntos de corte publicados por el CLSI (Clinical & Laboratory Standards Institute) de cada año correspondiente. En el caso de la tigeciclina, se utilizaron los puntos de corte publicados por EUCAST (European Comittee on antimicrobial susceptibility testing) para Escherichia coli. En el caso de la fosfomicina, se utilizaron los puntos de corte publicados por el CLSI para Escherichia coli. Tras la interpretación previamente mencionada, se clasificaron los microorganismos del estudio en multirresistentes (MDR), extremadamente resistentes (XDR) o panresistentes (PDR), según la clasificación de Magiorakos et. al . La detección fenotípica de mecanismos de resistencia a carbapenems se realizó, por un lado, mediante test bioquímico (ß-Carbatest de BioRad). El test se realizó a todas las cepas incluidas en el estudio, en microtubos a partir de colonias frescas de K. pneumoniae crecidas en agar sangre. Se observó un cambio de color (de amarillo a rojo o naranja) de la solución en los casos en los que había producción de carbapenemasas. La interpretación del resultado se realizó tras 30 minutos de incubación a 37ºC, según las indicaciones del fabricante. Por otro lado, también a nivel fenotípico, se llevó a cabo la determinación de la hidrólisis de carbapenems mediante el estudio de la sinergia de discos de carbapenémicos combinados con inhibidores (ROSCO Diagnostica). Se realizó una dilución 0.5 McFarland y se sembró en placas de agar Müeller-Hinton, incubándolas a 37ºC durante 18-24 horas. La caracterización de las ß-lactamasas de espectro extendido (BLEE), ß-lactamasas AmpC y carbapenemasas en los aislamientos de K.pneumoniae se realizó mediante la detección de los genes que codifican dichas resistencias por PCR isotérmica en el sistema comercial Eazyplex (Amplex Biosystems GmbH, Giessen,Germany) utilizando los kits Eazyplex ®Superbug CRE system y Eazyplex® AmpC. Esta prueba se realizó a todas las cepas incluidas en el estudio. Para determinar si cada aislamiento de K. pneumoniae se consideraba fenotipo hipermucoviscoso se realizó el “test de String” a todas las cepas incluidas en el estudio. Se llevó a cabo de la siguiente manera: con un asa de 1μl se tocó una colonia crecida en agar sangre tras 18 horas de incubación a 37ºC. Posteriormente, se realizó un movimiento hacia arriba en sentido perpendicular a la placa. Se consideraron cepas con fenotipo hipermucoviscoso aquellas que levantaron un filamento (o “cuerda” del inglés “string”) de más de 5 mm de longitud. El análisis del patrón de macrorrestricción del ADN cromosómico mediante electroforesis en campo pulsado fue utilizado en esta tesis doctoral para realizar estudios de clonalidad. Hasta la fecha se ha considerado el método de referencia ya que posee un elevado poder de discriminación y una excelente reproducibilidad. Todas las cepas se tipificaron mediante PFGE-RFLP en el CHEF-DR II (Bio-Rad) utilizando una endonucleasa de baja frecuencia de corte (XbaI), siguiendo el protocolo descrito por Han et. al. La interpretación de los patrones de bandas se hizo siguiendo criterios preestablecidos por Tenover. Tras el análisis visual, se consideraron clones idénticos aquellos que presentaron las mismas bandas, clones genéticamente relacionados aquellos que presentaron una diferencia de 3 o menos bandas y clones distintos cuando la diferencia fue de más de 3 bandas. Además, la comparación de los patrones de bandas también se realizó mediante el programa informático Bionumerics v7.6 (Applied Maths). La relación se calculó mediante el método UPGMA(Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Averages), que utiliza medias ponderadas según el número de elementos que hay en cada conglomerado. La similitud de bandas se determinó con el coeficiente DICE, que compara la similitud de dos muestras, con un valor de optimización del 1% y una tolerancia del 1.5%. Se asignó a cada clon distinto una letra del abecedario correlativa: A, B, C... etc. Cuando se trató de subtipos genéticamente relacionados se le asignó un número a la letra correspondiente: A1, A2, etc. También se llevaron a cabo experimentos de transferencia horizontal de material genético, adaptando el protocolo descrito por Möller et al. con el fin de demostrar la capacidad de diseminación de las carbapenemasas detectadas en las cepas de K. pneumoniae. Se seleccionaron dos cepas donantes: una productora de blaOXA-48 y otra productora de blaNDM-1. El ensayo se realizó en medio líquido, utilizando la cepa de Escherichia coli J53 (resistente a azida sódica) como cepa receptora . Las colonias crecidas en los medios de cultivo selectivos para el experimento (agar con ertapenem 0.5 μg/ml y azida sódica 100 μg/ml) fueron identificadas por espectrometría de masas MALDI-TOF, y el estudio de sensibilidad antibiótica se realizó de forma manual con discos de antibiótico (BD) de amoxicilina-clavulánico (20/10 μg), ertapenem (10 μg), meropenem (10 μg), ciprofloxacino (5μg) y gentamicina (10 μg), para comprobar que únicamente los genes de resistencia vehiculizados en plásmidos se encontraban en la cepa receptora. En el caso de haberse realizado la transferencia horizontal con éxito, únicamente deberíamos encontrar en la cepa receptora las resistencias antibióticas vehiculizadas en plásmidos (β-lactámicos principalmente y en función del plásmido también resistencia a otras familias de antibióticos como los aminoglucósidos) y no las cromosómicas (quinolonas). Posteriormente, se realizó el antibiograma completo mediante microdilución en caldo utilizando el sistema MicroScan (Beckman Coulter) para obtener las CMIs de los antimicrobianos necesarios. La secuenciación masiva de las cepas incluidas en esta tesis doctoral se realizó en el departamento de Genómica y Salud de la Fundación para el Fomento de la Investigación Sanitaria y Biomédica de la Comunidad Valenciana (FISABIO). Las etapas siguientes, que comprenden tanto el procesamiento de las lecturas como su análisis bioinformático, fue trabajo de esta tesis doctoral realizado por la doctoranda durante una estancia en dicho departamento. La extracción del ADN de todos los aislados se realizó en el Servicio de Microbiología del CHGUV a partir de cultivos de 18-24 horas de incubación en Müller-Hinton Agar (BD) mediante el método automatizado MagCore Automated Nucleic Acid Extractor (RBC BioScience). Previo a la secuenciación, se realizó la comprobación de la calidad del ADN genómico, así como su cuanBficación con Qubit uBlizando el dsDNA HS Assay Kit (InvitrogenTM). El kit proporciona soluciones para el reactivo de ensayo concentrado, el tampón de dilución y las seroalbúminas bovinas (DNA) prediluidas. Este método parte de 1 μl de muestra al que se añade una mezcla de tampón de dilución y el reactivo específico para la cuantificación de ADN de doble cadena en un volumen final de 200 μl. Una vez determinada la concentración de cada muestra, se realizaron alícuotas de 5 μl a 0,2 ng/μl que se emplearon para la secuenciación. La secuenciación masiva se realizó en un sistema Illumina NExtSeq 500 utilizando kits Nextera XT, DNA library preparation kit para la preparación de la librería y el Illumina Reagent kit v3. El flujo de trabajo que se siguió comprende tres grandes bloques: preprocesamiento de las secuencias (calidad y filtrado); tipado de las cepas, detección e identificación de genes de resistencia, plásmidos y factores de virulencia; reconstrucción del genoma: ensamblaje por mapeo y ensamblaje de novo, anotación de genes y plásmidos, estudio de mutaciones en porinas. Así pues, una vez obtenidas las secuencias en crudo, se realizó un control general de los millones de lecturas que se encuentran en cada archivo fastq utilizando las herramientas FastQC y MultiQC. Esta información es la que permitió decidir qué filtros de calidad utilizar para eliminar lecturas y mantener únicamente aquellas con buena calidad. El tipado de cada cepa mediante la caracterización de secuencias de varios loci (MLST) se realizó utilizando el programa ARIBA a partir de las lecturas obtenidas de la secuenciación masiva, utilizando una función que se conoce como “MLST-calling”. Para la detección de genes de resistencia a antimicrobianos presentes en cada uno de los aislados se utilizó ARIBA, que utiliza un algoritmo que agrupa la secuencias de referencia según su similitud utilizando CD-HIT v4.6. Este programa crea grupos o clusters de secuencias utilizando un umbral de similitud. En este caso agrupa todas las secuencias de la base de datos en el mismo grupo si comparten un 90% de similitud. Una vez agrupadas se ensamblan con FERMI-LITE v0.1, y la secuencia resultante se alinea y se compara mediante NUCMER v3.1 para elegir la referencia más cercana. ARIBA contiene distintas bases de datos con genes de resistencia: ARG-ANNOT, CARD, MEGARes y ResFinder, y las lecturas obtenidas a partir de la secuenciación se lanzaron contra estas cuatro bases de dato, con el fin de obtener la mayoría de los genes de resistencia presentes posible, ya que hay ligeras diferencias entre las bases de datos. Del mismo modo, ARIBA se utilizó también para la detección de factores de virulencia, lanzándose las lecturas contra la base de datos Virulence finder database, y para la detección de plásmidos utilizando la base de datos PLASMIDFINDER. Para la reconstrucción del genoma en esta tesis doctoral se utilizaron tanto el ensamblaje por mapeo (alineamiento de las lecturas contra un genoma de referencia lo más cercano posible al genoma que se quiere reconstruir) y el ensamblaje de novo (busca el solapamiento entre extremos de las lecturas, alargando así las lecturas cortas). El estudio epidemiológico de las cepas que parecían estar relacionadas se llevó a cabo, por un lado, a partir de los resultados obtenidos por la electroforesis en campo de pulso, así como mediante la obtención de árboles filogenéticos a partir de los genomas ensamblados utilizando IQTREE y la herramienta iTOL para su visualización. Resultados: Un total de 8612 aislados de K. pneumoniae se recogieron en el Consorcio Hospital General Universitario de Valencia desde enero del 2015 hasta diciembre del 2018, de los cuales 1013 resultaron resistentes a carbapenems, siendo 607 los obtenidos a partir de cultivos de vigilancia activa y 406 a partir de muestras clínicas. Se seleccionó un aislamiento por paciente (N=237). De los 237 pacientes, 150 fueron hombres y 87 mujeres, con rangos de edad entre 26-99 años, sin encontrar diferencias significativas entre hombres y mujeres. La mayoría de las muestras se obtuvieron de la Unidad de Cuidados Intensivos. Un total de 133 pacientes padecieron infección por K. pneumoniae resistente a carbapenems, de los cuales 58 ya estaban colonizados previamente. En cuanto a los factores de riesgo estudiados, se observó que existía riesgo estadísticamente significativo de sufrir infección por KPRC si el paciente había tenido un ingreso previo en el hospital, si había recibido antibioterapia o si había sido sometido a una cirugía previa. Además, también se observó una mayor probabilidad de infección en el caso de pacientes con diabetes mellitus, aquellos portadores de sonda urinaria y pacientes con enfermedad renal o pulmonar crónica. En cuanto al estudio de sensibilidad antibiótica, tras la realización del antibiograma se observó que entre las 237 cepas de KPRC ertapenem fue el carbapenem con mayor porcentaje de resistencia (100%), seguido por meropenem e imipenem. Además, más del 90% de los aislamientos resultaron resistentes a cefalosporinas de tercera generación y quinolonas. Se observó una resistencia moderada a tigeciclina y fosfomicina y, en cuanto a los aminoglucósidos, gentamicina y tobramicina presentaron mayores porcentajes de resistencia que amikacina. En el caso de trimetoprim-sulfametoxazol se detectó resistencia en el 75% de los aislamientos, y la colistina resultó uno de los antibióticos con mayor porcentaje de cepas sensibles. Cabe mencionar que no todos los antibióticos fueron testados en todas las cepas, puesto que el panel utilizado dependió del tipo de muestra del que se aisló cada cepa de K. pneumoniae. La multirresistencia antibiótica de K. pneumoniae es un fenómeno creciente a nivel hospitalario y también fue estudiado en esta tesis: El 84% de las cepas fueron clasificadas como multirresistentes, mientras que el 16% se clasificaron como extremadamente resistentes. El tipado de las cepas de K. pneumoniae incluidas en el estudio se realizó mediante MLST, detectando 22 secuenciotipos distintos. El ST307 fue el más frecuentemente detectado (N=78), seguido del ST11 (N=57) y ST101 (N=36). El estudio del resistoma se llevó a cabo de forma fenotípica (β-Carbatest y determinación de la inhibición de la hidrólisis de carbapenems) y fenotípica (PCR y secuenciación masiva). Un total de 118 aislados resultaron ser productores de la carbapenemasa OXA-48, 109 de los cuales también fueron clasificados como productores de BLEE. Se detectó co-producción de carbapenemasas en 7 casos (OXA-48 + NDM-1). En cuanto a genes de resistencia a antimicrobianos no β-lactámicos, cabe destacar la presencia de AadA2 en el caso de los aminoglucósidos, sul2 en el caso de las sulfonamidas, Dfra14 en el caso de trimetoprim y parC, GyrA, Qnr, Aac-6’-lbcr y OqxAB en el caso de las quinolonas. Se detectaron mutaciones en las porcinas de 191 aislados, siendo en todos los casos OmpK36 la proteína mutada. Se analizó la concordancia entre resistencia fenotípica y genotípica, obteniendo buenos resultados para la mayoría de los antimicrobianos excepto para aminoglucósidos, tetraciclinas, imipenem y meropenem, probablemente debido a… El estudio del viruloma de las cepas mostró que tan solo un aislamiento de K. pneumoniae presentaba el serotipo K1 y el gen rmpA, relacionados ambos con la hipervirulencia. Otros factores de virulencia identificados fueron yersiniabactina (N=106), colibactina (N=3), salmochelina (N=1) y aerobactina (N=8). En esta tesis doctoral se llevó a cabo la investigación de la diversidad de plásmidos presentes en las cepas de K. pneumoniae resistente a carbapenems utilizando las lecturas cortas obtenidas de la secuenciación masiva, con el fin de caracterizar los elementos genéticos móviles y su prevalencia en nuestro área, siendo el grupo de incompatibilidad IncFIB el más frecuentemente detectado (N=221), seguido de IncL (N=125). Con el fin de determinar qué plásmidos se asociaban con cada gen de resistencia a carbapenems encontrado en nuestro estudio, se llevó a cabo la anotación plasmídica a partir también de las secuencias obtenidas. En el caso de las cepas productoras de la carbapenemasa OXA-48 se observó una fuerte asociación entre el grupo de incompatibilidad IncL/M y el gen blaOXA-48, no encontrándose ningún otro gen de resistencia antibiótica en el mismo plásmido. Por el contrario, en cuanto al gen de la carbapenemasa NDM-1, se encontró en distintos grupos de incompatibilidad, siendo el mayoritario IncF. Además, estos plásmidos resultaron ser portadores de otros genes de resistencia además de blaNDM-1: RmtF, sul, blaDHA-1,blaCTX-M,etc. En nuestro estudio, tanto los resultados de la electroforesis en campo de pulso como la obtención de los árboles filogenéticos para la determinación de la relación epidemiológica de los aislamientos mostró que los clones más frecuentemente aislados pertenecían a los siguientes secuenciotipos: ST101 (clon A), ST11 (clones B1 y B2), ST307 (clones C1 y C2) y ST437 (clones D1 y D2). Estos cinco clones pertenecientes a cuatro secuenciotipos correspondieron al 85% de todos los aislamientos del estudio, siendo responsables de brotes asociados a salas a lo largo de los cuatro años investigados. En este estudio de ha llevado a cabo la caracterización molecular de 205 aislamientos de KPRC utilizando técnicas de secuenciación masiva, obteniendo así pues información sobre resistencia antibiótica, viruloma y relación epidemiológica de los aislamientos estudiados. Estos resultados muestran que las cepas de K. pneumoniae que circulan en nuestro área son portadoras de múltiples genes de resistencia antibiótica, así como de determinantes de virulencia, que se diseminan de forma clonal y por adquisición de plásmidos, coincidiendo con las conclusiones obtenidas en otros estudios similares. Además, también se llevó a cabo la identificación y la caracterización de los plásmidos involucrados en la resistencia antibiótica, que no hubiera sido posible utilizando las técnicas implementadas en la actualidad en los laboratorios de Microbiología. Hasta el momento, el impacto de la secuenciación masiva en la Microbiología Clínica había sido limitado. No obstante, está empezando a revolucionar el análisis epidemiológico para el control de la infección y la detección de brotes. En nuestro caso, la tecnología de secuenciación masiva ha sido una herramienta útil en la comprensión de los mecanismos de resistencia antibiótica, virulencia y la diseminación clonal de los aislamientos de KPRC. Limitaciones: La información de los ingresos de los pacientes fue en muchos casos limitada, especialmente en aquellos pacientes ingresados en la UCI por el diferente sistema de información utilizado. La información con respecto a la previa colonización de los pacientes infectados por KPRC también fue limitada, ya que el estudio de vigilancia activa solo se realiza a aquellos ingresados en la UCI. Al tratarse de un estudio retrospectivo, la recuperación de las cepas no fue satisfactoria para todas las incluidas en el estudio inicialmente.Los antimicrobianos más nuevos como ceftazidima-avibactam, ceftolozano-tazobactam, aztreonam-avibactam y cefiderocol no fueron estudiados. La característica de las secuencias obtenidas (secuencias cortas) no permitió cerrar completamente los plásmidos estudiados. Conclusiones: 1. En esta tesis doctoral se combinaron tanto técnicas tradicionales implementadas en la rutina del laboratorio de Microbiología como técnicas de última generación como la secuenciación masiva, con el fin de estudiar en profundidad las cepas de K. pneumoniae resistente a carbapenems que aparecieron durante los cuatro años del estudio en nuestro centro hospitalario. Las técnicas moleculares nos permitieron explorar ampliamente el resistoma, mobiloma, las variaciones genéticas dentro de la población de K. pneumoniae y la relación genética de los aislamientos. 2. Más de la mitad de los pacientes infectados y/o colonizados por K. pneumoniae resistente a carbapenems fueron mayores de 70 años, siendo la mayoría de los aislamientos de origen nosocomial. Los factores de riesgo relacionados con infección y/o colonización por KPRC que resultaron estadísticamente significativos fueron: cirugía previa o complicaciones derivadas de la misma, catéter urinario y enfermedad renal crónica. 3. La tasa de resistencias a antibióticos ß-lactámicos resultó elevada, siendo todos los aislamientos resísteles a ertapenem y con sensibilidad variable a imipenem y meropenem. La co-resistencia a otros antimicrobianos no ß-lactámicos fue detectada en la mayoría de las cepas del estudio: más del 90% resultaron resistentes a fluorquinolonas; alrededor del 70% a gentamicina y tobramicina y el 75% a trimetoprim-sulfametoxazol. Colistina, tigeciclina y fosfomicina fueron los antimicrobianos con mayores tasas de sensibilidad. 4. El gen blaAmpH se detectó en todos los aislamientos del estudio, seguido del gen blaSHV (97%), blaOXA-1 (81%), blaCTX-M (60%) y blaTEM (46%). La carbapenemasa más frecuentemente detectada mediante PCR y secuenciación masiva fue OXA-48 (50%), seguida de NDM-1 (16%). 5. La diversidad de secuenciotipos y K-tipos, la naturaleza multi-replicon de los plásmidos detectados y la co-existencia de factores de virulencia específicos con un elevado número de genes de resistencia antibiótica sugiere la posible emergencia de una población de K. pneumoniae no tratable. Los genes de la porina OmpK36 del 93% de los aislamientos presentaron mutaciones, sugiriendo un posible papel sinérgico en el fenotipo de multirresistencia de estas cepas. 6. El análisis filogenético indicó que los plásmidos portadores de carbapenemasas estaban asociados de manera no aleatoria con los clones de alto riesgo, diseminándose mediante expansión clonal y propagándose frecuentemente por los centros sanitarios. 7. Los brotes simultáneos que han ocurrido durante los cuatro años del estudio (2015-2018) ponen de manifiesto la importancia de caracterizar estos aislamientos con el fin de parar su diseminación. La caracterización de las cepas de KPRC realizada en este estudio es la primera llevada a cabo mediante secuenciación masiva de nuestro área. Es, además, la primera vez que se describe la detección de K. pneumoniae co-productora de blaOXA-48, blaNDM-1 y blaCTX-M-15. Además, se detecta también por primera vez blaNDM-23 en tres cepas de nuestro estudio. 8. Aunque las técnicas de secuenciación masiva no pueden suplantar completamente a los métodos tradicionales de determinación de sensibilidad a los antimicrobianos, están empezando a revolucionar el futuro de la Microbiología Clínica.