Schutz vor Infektion mit dem Cytomegalievirus durch glykoproteinspezifische monoklonale Antikörper

The principal focus of this work was the dissection of the humoral immune response against the murine cytomegalovirus (mCMV). mCMV was chosen, because it can be considered a model system for the infection and pathogenesis of the human cytomegalovirus (hCMV). An infection with hCMV is currently the most frequent vertically transmitted infectious disease. Many newborns suffer from long-term medical conditions caused by hCMV infection. hCMV infection is also a leading cause of serious complications, morbidity and mortality in immunosuppressed transplant recipients or AIDS patients. The analysis of the humoral immune response directed against viral glycoproteins, above all against glycoprotein B (gB), was of particular interest. The problem was addressed with two different approaches. Firstly, monoclonal antibodies were generated from B-cells of infected mice using the hybridoma technique. These antibodies were then analyzed for their antiviral potential in vitro, that is, their capability to inhibit infection of susceptible target cells in cell culture. Many isolated antibodies were able to neutralize mCMV in vitro. Most of the antibodies, however, were non-neutralizing. We further successfully identified the target structures of antiviral antibodies. The majority of neutralizing antibodies was directed against antigenic domains on gB. One antiviral antibody that was extraordinarily potent in vitro recognized yet another envelope glycoprotein, gN. The 3D structure of gB had been modeled computationally. A structural domain shown therein was demonstrated to comprise the epitope of a virus neutralizing antibody, which was isolated in this work. In addition, the epitope of another antiviral antibody was identified. Its homologous domain in hCMV (AD-1) has been described to be highly immunogenic. When determining the seropositivity rate against the two domains, the AD-1 homologous domain was demonstrated to be recognized by 100% of mCMV infected animals. DomII was also highly immunogenic. 90% of all infected mice mounted antibody responses against DomII. These findings correspond to the immune response of hCMV infected individuals against these domains. In vivo experiments focused on one DomII-specific antibody with neutralizing activity (1F11) and one non-neutralizing AD-1-specific antibody (5F12). Additionally the in vivo antiviral activity of the gN-specific antibody (32.22) was analyzed. All three antibodies were found to transfer protection against lethal challenge with mCMV when present at the time of infection. It is even possible, that sterilizing immunity was provided. Moreover, the neutralizing antibodies achieved a reduction of the viral load in mice with an already established infection. Thus, in this study for first time mCMV-specific antibodies with known protein targets were isolated that are able to protect against infection with mCMV. The second approach focused on the immunization with the described immunogenic domains of gB. For this, DomII and AD-1 were prokaryotically expressed as GST fusion proteins and purified. Mice were immunized in a prime-boost fashion and the immune response towards these antigens was monitored. Both proteins induced specific antibodies following vaccination. DomII was shown to be particularly immunogenic. The induced antibodies, however, were not able to prevent the infection of susceptible target cells in vitro. Also, the transfer of DomII-specific B-cells or a specific serum pool did not provide protection against infection in vivo. The immunization with UV-inactivated mCMV, on the other hand, led to the induction of antibodies with antiviral activity. This shows that protective immunity against mCMV infection can be induced. It will be the concern of future studies to modify the candidate vaccines in a way that they prompt protective antibody titers. In dieser Arbeit wurde die humorale Immunantwort im Schutz gegen die Infektion mit dem murinen Cytomegalievirus (mCMV) untersucht. mCMV diente hierbei als Modellsystem für die Infektion und Pathogenese des humanen Cytomegalievirus (hCMV). Die Infektion mit hCMV ist heute die häufigste vertikal übertragene Infektionskrankheit und viele Neugeborene leiden unter Langzeitbeschwerden, die durch die Infektion hervorgerufen werden können. Zudem kann der Ausbruch von hCMV in Empfängern von Organtransplantaten oder AIDS Patienten zu schweren Komplikationen führen. Von besonderem Interesse für diese Arbeit war die Analyse der Immunantwort gegen virale Glykoproteine, in erster Linie gegen das immundominante Glykoprotein B (gB). Dafür wurden zwei Arbeitsansätze ausgewählt. Im ersten Arbeitsansatz wurden mittels Hybridomtechnik monoklonale Antikörper aus B-Zellen infizierter Mäuse erfolgreich hergestellt. Diese Antikörper wurden in vitro auf ihr Potential hin untersucht mCMV zu neutralisieren, das heißt die Infektion suszeptibler Zielzellen zu verhindern. Viele isolierte Antikörper zeigten diese Fähigkeit, jedoch waren die meisten Antikörper nicht neutralisierend. Zudem wurden die Zielproteine antiviraler Antikörper identifiziert und die Positionen der Epitope darauf genauer eingegrenzt. Es stellte sich heraus, dass der Großteil der neutralisierenden Antikörper, die während einer mCMV Infektion hergestellt werden, gegen gB gerichtet ist. Ein weiterer Antikörper, der in vitro besonders potente antivirale Eigenschaften zeigte, erkannte Glykoprotein N (gN), das wie gB in der Virushülle eingelagert ist. Mit Hilfe bioinformatischer Methoden wurde die 3D Struktur von gB modelliert. Eine hierbei identifizierte strukturelle Domäne (DomII) enthält das Epitop eines in dieser Arbeit beschriebenen neutralisierenden Antikörpers. Des Weiteren wurde in Homologie zu hCMV der C-terminale Bereich AD-1 als Bindestelle für einen antiviralen Antikörper identifiziert. Die Analyse von Seren infizierter Tiere zeigte eine Seropositivitätsrate von 100% für die Erkennung von AD-1. DomII wurde von 90% der Seren erkannt. Dies entspricht der Seropositivitätsrate von infizierten Personen gegen die entsprechenden Domänen auf hCMV. Zwei in vitro neutralisierende Antikörper und ein nicht—neutralisierender Antikörper wurden ausgewählt und für in vivo Versuche erfolgreich aufgereinigt. Der nicht-neutralisierende Antikörper erkannte AD-1. Ein neutralisierender Antikörper war gegen DomII gerichtet und der andere erkannte ein Epitop auf gN. In Schutzversuchen zeigte sich, dass alle drei getesteten Antikörper die Infektion mit mCMV verhindern können, wenn sie zum Zeitpunkt der Infektion vorhanden sind. Wahrscheinlich wurde hier sogar sterilisierende Immunität erzielt. In der Therapie einer etablierten mCMV Infektion konnten die neutralisierenden Antikörper die Infektion eindämmen und einen Überlebensvorteil bewirken. In dieser Arbeit wurden somit zum ersten Mal mCMV spezifische Antikörper mit in vivo antiviralen Eigenschaften und bekannter Epitopspezifität beschrieben. Der zweite Arbeitsansatz befasste sich mit Immunisierungsstudien, basierend auf Fragmenten von gB. Dafür wurden die relevanten Bereiche (AD-1 und DomII) im prokaryonten System als Fusionsproteine aufgereinigt und in ‚Prime-Boost‘ Schritten an die Tiere verabreicht. Beide Proteine induzierten nach der Immunisierung spezifische Antikörper. DomII stellte sich dabei als außergewöhnlich immunogen heraus. Die induzierten DomII oder AD-1 spezifischen Antikörper konnten jedoch im in vitro System die Infektion suszeptibler Zellen nicht verhindern. Die Verabreichung von DomII-spezifischen B-Zellen oder eines spezifischen Serumpools zeigte auch in vivo keinen antiviralen Effekt. Dagegen wurden nach Immunisierung mit UV-inaktiviertem mCMV Antikörper induziert, die in der Lage waren die Infektion einzudämmen. Eine sterile Immunität wurde hier jedoch nicht beobachtet. Es bleibt die Aufgabe nachfolgender Studien, die Impfstoffe derart zu modifizieren, dass antivirale Antikörper induziert werden und ein Schutz gegen die Infektion mit mCMV erreicht wird.