Die Besiedelung von Zellen auf elektrogesponnenen, biologisch abbaubaren Gerüsten für die Herstellung von Gefäßprothesen

Zusammenfassung 1. Hintergrund und Ziele Immer mehr Patienten und Patientinnen leiden an akuten Koronarsyndromen, die durch atherosklerotisch veränderte Herzkranzgefäße verursacht werden. Der Ersatz dieser Gefäße durch körpereigenes Material ist nur begrenzt möglich, und die künstlichen Gefäßprothesen erfüllen oft nicht die gewünschten Kriterien, da das Risiko der Restenose und der Thrombusbildung bei kleinen Gefäßprothesen sehr schwer zu kontrollieren ist. Daher wird im Bereich des "Tissue Engineering" intensiv geforscht, um Gefäßprothesen mit kleinem Durchmesser mit optimaler Biokompatibilität und mechanischen Eigenschaften für den menschlichen Körper herzustellen. In dieser Arbeit werden spezielle elektrogesponnene biologisch abbaubare Polymere mit und ohne Seidenfibroin (SF) als potenzielles Material für Gefäßprothesen untersucht. 2. Methoden Um die beste Polymermischung als Grundlage für die Gefäßprothese zu ermitteln, wurden Zellexperimente mit primären menschlichen Endothelzellen (HUVECs) und Fibroblasten auf flachen Matten aus Poly(ε-Caprolacton) (PCL) in verschiedenen Fasergrößen (Mikro, Nano und PCL/SF) durchgeführt. Die Ergebnisse wurden metabolisch und durch Fluoreszenzmikroskopie 1, 3 und 7 Tage nach der Aussaat untersucht. Für die magnetische Zellmarkierung wurden superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel (SPIONs) verwendet. Zur Bestimmung der Toxizität wurden die Zellen 24 Stunden lang mit verschiedenen Konzentrationen von SPIONs inkubiert und anschließend die Lebensfähigkeit der Zellen und die Eisenmenge pro Zelle bestimmt. Um den Vorteil der magnetischen Besiedlung gegenüber der konventionellen Besiedlung zu zeigen, wurden diese beiden Ansätze direkt miteinander verglichen. Anschließend wurden die röhrenförmigen PCL/SF-Gerüste mit Hilfe von radialer Magnetkraft durch den Vascu-cell-Endothelizer mit Zellen besiedelt und nach 1 und 7 Tagen ausgewertet. 3. Ergebnisse und Beobachtungen Bei der Besiedelung der flachen PCL Matten zeigte sich die Mischung aus PCL und SF als effizientestes Substrat für sowohl Fibroblasten als auch HUVECs. Fibroblasten bildeten mehrere Zellreihen und ordneten sich parallel an, HUVECs bildeten die typischePflastersteinformation aus. Daher wurde das Gemisch aus PCL und Seidenfibroin, das eine Fasergröße im Bereich um 449 nm (± 163 nm) aufzeigte, für die tubulären Experimente ausgewählt. Fibroblasten und HUVECs reagierten unterschiedlich stark auf die potenziell toxischen SPIONs. Es konnte eine höhere Konzentration von Eisenoxiden in HUVECs als in Fibroblasten nachgewiesen werden. Ab einer Konzentration von 4 µg/cm 2 (HUVECs) und 7 µg/cm 2 (Fibroblasten) SPIONs im Nährmedium ist es nach 24 h Inkubation zu einem sprunghaften Abfall lebendiger Zellen gekommen. Die magnetische Besiedelung zeigte einen initialen Vorteil gegenüber der konventionellen Besiedelung. Es waren mehr Zellen insgesamt zu finden und deren Morphologie nach 30 Minuten bis 3 Stunden nach der Aussaat differenzierter. In der dreidimensionalen magnetischen Besiedelung zeigte sich, dass HUVECs in Monokultur zwar an der luminalen Seite der PCL/SF Prothese anwachsen, eine Konfluenz nach 7 Tagen aber nicht erreicht werden konnte. Vorherige Ergebnisse mit Co-Kolonisation mit Fibroblasten zeigten eine unterstützende Wirkung für HUVECs. Die Co-Kolonisation der Prothesen erwies diesen gewünschten Effekt. Es konnte eine eindeutige, flächendeckende Pflastersteinmorphologie mit CD31 Antikörperfärbung nachgewiesen werden. 4. Schlussfolgerungen und Diskussion Die Ergebnisse zu den Einflüssen der Fasergröße und der Verwendung von Seidenfibroin decken sich gut mit den Ergebnissen anderer Studien. So sind Fasern im Nanometerbereich mit Seidenfibroin das Substrat, das beide Zelltypen am besten unterstützt. Insbesondere die Ausbildung der Pflastersteinmorphologie, die hohe metabolische Aktivität der Zellen und reichliche Proliferation auf PCL/SF zeigen, dass sich die Zellen in der künstlichen EZM gut entwickeln. Für die magnetische Besiedelung mit SPIONs ist es wichtig, die maximale Dosis der Zellen zu ermitteln und zu beachten, da sonst toxische Effekte, insbesondere Schäden an der DNA auftreten können. Die magnetische Besiedelung von elektrogesponnenen PCL/SF Prothesen zur Herstellung von kleinen Gefäßtransplantaten kann ein vielversprechender Ansatz im Bereich des „tissue engeneering“ darstellen. Dies zeigt die erfolgreiche Beschichtung mit der Co-Kultur aus Fibroblasten und HUVECs. Entscheidend ist anscheinend die Verwendung von Co-Kulturen, da erst dies zu der typischen Ausbildung von Pflastersteinformationen führte. Es müssen noch zahlreiche Experimente in vitro und invivo erfolgen, um den tatsächlichen Nutzen dieser Kombination von Techniken einschätzen zu können. In zukünftigen Studien wird die Langzeitevaluation mehrerer solcher Prothese in vivo entscheidend sein, um das Auftreten von Stenosen durch Intimahyperplasien und Thrombosen beobachten zu können.