Structure and function of the HIV-1 gag-protein p6

Das HIV-1-Protein p6 ist im C-terminalen Bereich von Gag lokalisiert und besitzt trotz seiner geringen Größe von nur 52 Aminosäuren eine komplexe strukturelle und funktionelle Organisation. Es bindet mindestens zwei zelluläre Buddingfaktoren (Tsg101 und ALIX) sowie zwei virale Proteine (Vpr und Env) und übt eine Vielzahl biologischer Funktionen aus. Außerdem besitzt p6 sowohl C- als auch N-terminal jeweils eine L-Domäne, welche unter anderem den letzten Schritt in der Abschnürung des naszierenden Virions von der Zellmembran, in einem bis heute noch nicht vollständig geklärten Mechanismus, regulieren. Neben den Modifikationen der Ubiquitinylierung und Sumoylierung fungiert p6 außerdem als Substrat für verschiedene Kinasen: Im Jahr 2002 wurde p6 als Hauptphosphoprotein in HIV-1-Partikeln identifiziert und es konnte gezeigt werden, dass p6 durch die MAP-Kinase ERK-2 an der Position Thr-23 phosphoryliert wird. Weiter gibt es Hinweise, dass die genannte Kinase durch die Phosphorylierung an Thr-23 von p6 den Viruszusammenbau sowie die Virusfreisetzung reguliert. Zur Identifikation weiterer potentieller Kinasen wurde zu Beginn dieser Arbeit eine in silico Analyse durchgeführt und schließlich mittels in vitro Experimenten mit synthetischem und viralem p6-Peptid die Proteinkinase C, welche spezifisch Ser-Reste an Position 14, 25 und 40 in p6 phosphoryliert, identifiziert. Vergleicht man die Konsensussequenzen verschiedener HIV-1-Isolate der M-Hauptgruppe, so ist eine absolute Konservierung von Ser-40 festzustellen, was auf eine mögliche biologische Funktion dieser Stelle hindeutet. Zur Untersuchung der biologischen Funktion der Phosphorylierungsstellen in p6 wurden Konstrukte kloniert, die an den identifizierten Ser-Resten mutiert wurden. Die Substitution aller Ser-Reste einzeln zeigte in Infektionsstudien, dass nur die Mutation von Ser-40 zu einer verminderten Replikationskapazität in T-Zellen sowie in primären humanen Zellen führte. Die Mutation von Ser-14 und Ser-25 zeigte keinen Effekt auf die Replikation von HIV-1. Die Mutation aller drei PKC-Stellen zusammen führte hingegen zu einem kompletten Verlust der Replikationsfähigkeit. Obwohl die Mutation der Phosphoakzeptorstellen die Freisetzung der Viruspartikel nicht beeinflusste, sind die produzierten Virionen der Ser-40-Mutante weniger infektiös und die Dreifachmutation führte sogar zu einem kompletten Verlust der Infektiösität. Als molekularer Mechanismus hinter diesem Phänomen konnte in Pulse-Chase Experimenten beobachtet werden, dass die CA-Prozessierung von p25 zu p24 im Fall der Ser-40-Mutante gestört ist. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass der Defekt in der CA-Prozessierung zu einer irregulären Core-Morphologie und zur Bildung einer elektronendichten Struktur außerhalb des Cores führt. Die erhaltenen Ergebnisse belegen eine neue, bis heute unbekannte Funktion von p6, die nicht die Virusfreisetzung, sondern die Gag-Prozessierung betrifft. Das konservierte Ser-40 reguliert auf noch unbekannte Weise, womöglich durch PKC-Phosphorylierung, die CA-Reifung und somit die Infektiösität von HIV-1. Neben den verschiedenen Bindungsstellen für virale und zelluläre Proteine sowie den Modifikationsstellen besitzt p6 die inhärente Fähigkeit zur Ausbildung oligomerer Formen. Diese wurden durch die Behandlung von sp6 und vp6 mit chemischen Crosslinkern und anschließender Western Blot Analyse untersucht. Es zeigte sich, dass das C-terminale Fragment von p6 oligomere Strukturen ausbildet. Somit konnte der in silico Befund, dass p6 eine im C-terminalen Bereich lokalisierte Oligomerisierungsdomäne besitzt, bestätigt werden. Ob diese Oligomerisierungsdomäne in p6 zur Gag-Gag-Multimerisierung, welcher eine wichtige Rolle in der Gag-Assemblierung und der Produktion von Viruspartikeln zukommt, beiträgt, sie eine ganz andere funktionelle Relevanz hat oder gar funktionslos ist, ist bislang nicht bekannt. The HIV-1 protein is located at the C-terminus of Gag and despite its small size of 52 amino acids it comprises a quite complex structural and functional organization: it binds at least two cellular budding factors (Tsg101 and ALIX) as well as two viral proteins (Vpr and Env) and it exerts a variety of biological functions. Among others, it regulates the final abscission step of the nascent virion from the cell membrane by the action of two different l domains, one located at the C- and one located at the N-terminus of the peptide, in a yet not completely elucidated mechanism. Besides the ubiquitinylation and sumoylation p6 acts as a substrate for distinct kinases: 2002 p6 was identified as the major phosphoprotein found in HIV-1 particles and it could be shown that phosphorylation of p6 by MAP-kinase ERK-2 at position Thr-23 regulates the assembly and release of progeny virions. To identify further potential kinases an in silico analysis was performed and finally in vitro experiments with synthetic and viral p6 identified PKC to specifically phosphorylate Ser residues in position 14, 25 and 40 in p6. When the consensus sequences derived from various HIV-1 group M isolates were compared, one can see that Ser-40 is absolutely conserved. Therefore, the biological function of this site has to be identified. To analyze the biological function of the identified phosphorylation sites, different constructs carrying mutations of the identified Ser residues were generated. Individual substitutions of the Ser residues revealed that only mutation of Ser-40 reduced virus replication in T-cell lines and in primary human cells, while mutation of Ser-14 and Ser-25 had no effect on the replication. In contrast, mutation of all three PKC-sites completely abrogated replication. Although mutation of PKC sites had no influence on virus release, the infectivity was reduced for the Ser-40 mutant and completely lost for the triple mutant. As molecular mechanism behind this phenomenon pulse-chase experiments illustrated that the efficiency in final processing of CA from p25 to p24 was dependent on the integrity of Ser-40. Electron micrographs showed that the defect in CA processing led to an irregular morphology of the virus core and the formation of an electron dense extra core structure. Thus, the obtained results support a novel, till this day unknown function of p6, that does not affect virus release but concerns Gag processing. The conserved Ser-40 regulates in a yet unknown manner CA maturation and thereby infectivity of HIV-1 in a process that might involve PKC phosphorylation. In addition to the different binding sites for viral and cellular proteins and the modification sites p6 displays the inherent ability to undergo oligomerization. This observation was analyzed by incubating sp6 and vp6 with chemical crosslinkers and western blotting. It turned out that the C-terminal fragment of p6 has the propensity to form oligomeric structures. This is consistent with in silico analysis, which predicts an oligomerization domain in the C-terminus of p6. Whether this oligomerization domain in p6 contributes to the Gag-Gag multimerization, which has an important role in Gag assembly and virus particle production, or whether it has a complete different functional relevance or it is totally out of any function is previously not known.