Μελέτη των ριβονουκλεοπρωτεϊνικών συμπλόκων vaults σε φλεγμονώδεις παθήσεις

Τα vaults είναι οι μεγαλύτερες ριβονουκλεοπρωτεΐνες που έχουν περιγραφεί έως σήμερα στο εσωτερικό των ευκαρυωτικών κυττάρων, με μάζα 13ΜDa. Το μεγάλο τους μέγεθος, τους δίνει την δυνατότητα να ενδοθυλακώνουν πολλές πρωτεΐνες και RNAs του κυττάρου. Τα vaults αποτελούνται από την κύρια vault πρωτεΐνη (MVP), δυο μικρότερες πρωτεΐνες την VPARP και την TEP1, καθώς και από μόρια RNA. Τα σωματίδια αυτά έχουν την ικανότητα, σε όξινο pH, να διαχωρίζονται σε δυο συμμετρικά κομμάτια τα οποία μπορούν να επανασυρμολογηθούν. Σύμφωνα με επιστημονικές δημοσιεύσεις, τα vaults σχετίζονται με το φαινόμενο αντίστασης στην χημειοθεραπεία και διαδραματίζουν ρόλο στην διαδικασία της φλεγμονώδους αντίδρασης. Επιπρόσθετα, αποδίδεται σε αυτά τα σωματίδια κάποιος ρόλος και στις περιπτώσεις των ρευματικών νοσημάτων. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, στόχος ήταν η μελέτη των vaults σωματιδίων και των συστατικών τους σε φλεγμονώδη νοσήματα. Για το σκοπό αυτό, τα επίπεδα των vaults αναλύθηκαν σε ασθενείς και σε υγιή άτομα. Η MVP αποτελεί >70% της συνολικής μάζας των vaults σωματιδίων. Με βάση, λοιπόν, την γνωστή τρισδιάστατη δομή των vaults σωματιδίων του αρουραίου, σχεδιάστηκαν δυο πιθανοί επίτοποι της MVP και χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή αντισωμάτων σε δύο διαφορετικά πειραματόζωα. Τα αντισώματα αυτά, εν συνεχεία, χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη μιας sandwich ELISA, που αποσκοπούσε στην ποσοτικοποίηση της MVP. Προκειμένου να αυξηθεί η ευαισθησία της μεθόδου, ενσωματώθηκε και ένα σύστημα ενίσχυσης της ELISA (ELISA Amplification System). Τα πεπτίδια που παρήχθησαν, χρησιμοποιήθηκαν περαιτέρω και για την ανάπτυξη μεθόδου ανίχνευσης αυτοαντισωμάτων έναντι της MVP, στον ορό του αίματος. Επιπρόσθετα, στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η πιθανότητα τα vaults να απελευθερώνονται στον ορό του αίματος, αφού έχουν ενδοθυλακώσει μόρια από την περιοχή της φλεγμονής. Για τον σκοπό αυτό, επιχειρήθηκε η ανίχνευση του vault RNA, με την μέθοδο της PCR, στον ορό του αίματος, καθώς και η ανοσοκατακρήμνιση των vaults με την χρήση μαγνητικών σφαιριδίων ή υπερφυγοκέντρησης σε διάλυμα γραμμικά διαβαθμισμένης συγκέντρωσης σουκρόζης. Τα αποτελέσματά μας κατέδειξαν, ότι η MVP είναι αυξημένη στον ορό του αίματος ασθενών με PA και EΡΑ. Έτσι, λοιπόν, η MVP θα μπορούσε να αποτελέσει έναν νέο βιοδείκτη για την διάγνωση της ΡΑ. Η MVP, μάλιστα, συνδυαστικά με άλλους βιοδείκτες που χρησιμοποιούνται ευρέως στην κλινική πράξη (όπως anti-CCP και RF), μπορεί να αυξήσει την διαγνωστική ακρίβεια στην περίπτωση της ΡΑ και της ΕΡΑ. Εν συνεχεία, εξετάστηκε εάν η MVP σχετίζεται με τον είδος της θεραπείας που χορηγείται στους ασθενείς με ΡΑ. Διαπιστώθηκε ότι ένας ασθενής με υψηλά επίπεδα MVP είναι πιο πιθανό να μην ανταποκριθεί θετικά στην θεραπεία, από ότι ένας ασθενής με χαμηλά επίπεδα MVP. Επιπρόσθετα, τα επίπεδα της MVP βρέθηκαν υψηλά σε ασθενείς με φλεγμονή, συγκριτικά με τα υγιή άτομα. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσίασε η ανίχνευση αυτοαντισωμάτων σε ασθενείς με αυτοάνοσα νοσήματα (ΡΑ, σύνδρομο Sjögren). Τέλος, μετά από μοριακή ανάλυση στους ορούς ασθενών και υγιών ατόμων, καθώς και προσπάθεια κατακρήμνισης των vaults από τους συγκεκριμένους ορούς, διαπιστώθηκε ότι τα vaults πιθανά δεν κυκλοφορούν στον ορό του αίματος. In the cytoplasm of eukaryotic cells, vaults comprise the largest ribonucleoprotein particles. They are “huge”, in molecular terms, barrel shaped particles with a molecular weight of 13 MDa. Vaults are assembled from three proteins; MVP, VPARP, TEP1 and small untranslated RNA (vRNA). In low pH, vaults tend to split at the middle in two symmetrical halves. Several researchers have suggested a role for the vaults in cancer cells’ ability to resist chemotherapy and in inflammation process. Some data also, indicate a possible involvement of the vaults in rheumatic diseases. This research aimed to examine the role of vaults in inflammatory process. Since MVP accounts for >70% of the vaults’ mass, it was first, set up an assay for MVP quantification. Two different peptides were synthesized. The peptides used in order to examine the ability of MVP to act as an autoantigen. In this regard, autoantibodies in sera of patients with RA, SLE, Sjögren syndrome and healthy individuals were quantified. Furthermore, peptides were used for immunization of two experimental animals. The antibodies which produced, were used in order to set up a sandwich ELISA for quantitification of MVP between two layers of antibodies, one antibody for the capture of MVP and the other for its detection. In order to increase the sensitivity of this method, it was incorporated an ELISA amplification system. We, also aimed to analyze the vaults’ cargo, since it is likely that they encapsulate molecules from the site of inflammation, from where they (the vaults) are most probably released into the systemic circulation. In this regard, we tried to isolate vault particles using magnetic bead protein purification system or sucrose gradient ultracentrifugation. We also attempted to carry out nucleic acid analysis, in order to detect vault RNA in sera. Our results indicated that, the levels of MVP were high in patients with RA and ERA as compared to OA and healthy individuals, suggesting that MVP in conjunction with biomarkers that are used in clinical practice (e.g anti-CCP and RF), is able to severe as a novel biomarker in case of RA and ERA. We also examined if MVP could be correlated with the type of treatment administered to RA patients. It was indicated that a patient with high MVP concentration is more likely to be a non-responder to the treatment. Furthermore, autoantibodies against MVP were detected in sera of patients with autoimmunue diseases (e.g. RA and Sjögren syndrome). Finally, molecular analysis and implementation of protocols that aim to isolation of vault particles from serum, pointed out that vault are not probably circulate in sera.