Effects of long-term exposure to an antibiotic in zebrafish: from the organism to the microbiome level

Due to high food demand, aquaculture is one of the fastest growing industries. Hence, to supply all the needs, organisms are commonly grown under stress conditions (e.g. overcrowded) which favor the emergence and spread of infectious diseases. To combat this problem, broad-spectrum antibiotics such as oxytetracycline (OTC) are used. Since organisms are not able to absorb all the antibiotic consumed, it is known that a large part of these compounds is excreted in its active form and released to the environment. Once in the environment, antibiotics can have effects on non-target organisms such as fish, their microbiome, and the bacterial communities in the water. Thus, this work aimed to study, the impact of antibiotics, namely OTC, on zebrafish in an integrated analysis at various levels of biological organization. For this purpose, in a first experience, adult zebrafish were exposed to OTC for two months via water. The analysis of the effects was performed at a sub-individual level (e.g. enzyme activity), individual (e.g. behavior) and microbiome (e.g. structure, function, and selection of bacteria resistant to OTC and resistance genes). Then, to verify the reversibility of effects in a non-continuous exposure scenario, after a long-term exposure period, organisms were transferred and kept in clean water for one month. In this experiment, the analysis of the effects was performed at a sub-individual level (e.g. enzyme activity), and in the microbiome (e.g. structure, function, and selection of bacteria resistant to OTC and resistance genes). Analyses during the exposure (five days and two months of exposure) and in the post-exposure period (five days and one month of post-exposure) were also performed. During the exposure period, our results revealed that OTC had an impact in organisms at several biological organization levels. At a sub-individual level, a decrease in the detoxification mechanisms and cellular energy available was observed. At individual level, an increase of stress response was observed through the increase of hyperactivity of fish. At bacterial communities’ level, OTC exposure induced changes at structure and functional level in both fish gut and water. For instance, in water samples ou results suggested the selection of some bacterial phylotypes that play a role in the nitrogen cycle. Regarding the post-exposure period, in both parameters analyzed (energetic reserves and bacterial communities’ structure and function) differences between the exposed and control group were minimized indicating a recovery in the fish gut and water. The role of OTC in the selection of antibiotic-resistant bacteria and antibiotic resistance genes was also verified. Namely, the selection of resistant bacteria indicated as potential pathogens to humans and fish was observed. Moreover, the pathogenic potential of some isolates was tested and confirmed in vivo. Overall, our work demonstrated that the water contamination with the antibiotic has an impact in zebrafish with consequences at several levels analyzed. The use of sensitive endpoints, that may act like early warning signals, allowed to assess effects at low concentrations. The effects observed at organisms’ level (e.g. behavior change, energy reserves) can compromise fish ability of prey capture and predator avoidance, leading to further consequences at population level. Moreover, the selection of potential pathogens and/or bacterial phylotypes related with nitrogen cycle may have an impact at ecosystem level. Hence our work reinforces the importance of interdisciplinary studies for a deeper understanding of the real impact of antibiotics in the environment. Para dar resposta à crescente necessidade de produção de alimentos, algumas indústrias têm assistido a um grande desenvolvimento, como é o caso das aquaculturas. De modo a atingir as metas pretendidas, os organismos são comummente mantidos em condições sub-ótimas (ex. altas densidades) favorecendo o aparecimento e disseminação de doenças. Para combater este problema, são utilizados antibióticos de largo-espectro como é o caso da oxitetraciclina (OTC). Uma vez que grande parte do composto consumido não é metabolizado pelo organismo, o antibiótico é excretado na sua forma ativa e libertado para o meio ambiente. Uma vez no meio ambiente, os antibióticos podem ter efeitos nos organismos não alvo como por exemplo nos peixes, no seu microbioma e nas comunidades bacterianas da água. Assim, este trabalho teve como objetivo estudar o impacto de antibióticos, nomeadamente da OTC, no peixe-zebra, numa análise integrada e dirigida a vários níveis de organização biológica. Para isso, numa primeira experiência, expuseram-se peixes-zebra adultos a OTC por dois meses. Foram analisados os efeitos a nível sub-individual (ex. atividade enzimática), do indivíduo (ex. comportamento) e do microbioma tanto dos organismos como da água de exposição (ex. estrutura, função e seleção de bactérias e genes de resistência à OTC). Em seguida, foi realizada uma experiência para verificar a reversibilidade dos efeitos observado. Neste caso os organismos foram expostos por dois meses nas mesmas condições e, seguidamente, foram transferidos para água limpa e assim mantidos durante um mês. Nesta experiência, foram analisados efeitos a nível sub-individual (ex. atividade enzimática), e no microbioma dos organismos e da água de exposição. Os efeitos foram avaliados tanto durante o período de exposição (cinco dias e dois meses de exposição) como no período de pós-exposição (cinco dias e um mês pós-exposição). Os resultados permitiram verificar que a OTC tem um impacto nos vários níveis de organização. A nível sub-individual, foi observada uma inibição dos mecanismos de destoxificação e a redução da energia celular disponível. A nível do indivíduo, a OTC provocou uma alteração do comportamento dos peixes, verificando-se hiperatividade como resposta ao stress químico. A nível das comunidades bacterianas, verificou-se uma alteração tanto a nível da estrutura como das funções das comunidades. Por exemplo, na água, os resultados sugeriam a seleção de bactérias que estão relacionadas com o ciclo do azoto. No período de pós-exposição foi possível verificar que tanto a nível das reservas energéticas como a nível do microbioma dos peixes e da água de exposição, as diferenças entre grupos expostos e grupo controlo diminuíram, sugerindo uma possível recuperação. A OTC demonstrou ter também um papel na seleção de bactérias resistentes a antibióticos e genes de resistência. Nomeadamente foi observada a seleção de géneros bacterianos indicados como potenciais patogénicos de peixes e humanos. O potencial patogénico de alguns isolados foi confirmado em ensaios in vivo. No geral este estudo demonstrou que a presença de OTC na água tem um efeito no peixe-zebra com consequências nos vários parâmetros analisados. O uso de parâmetros sensíveis, que podem funcionar como sinais de alerta precoce, permitiu observar efeitos mesmo após exposição a baixas concentrações do composto. Os efeitos observados ao nível dos organismos (ex. alteração do comportamento, reservas de energia) podem comprometer a capacidade dos peixes de capturar presas e evitar predadores, levando a consequências posteriores ao nível da população. Também, a seleção de potenciais bactérias patogénicas e/ou filotipos bacterianos relacionados com o ciclo do azoto pode vir a ter um impacto ao nível do ecossistema. Assim, o nosso trabalho demonstra a importância de mais estudos interdisciplinares para uma compreensão mais profunda do real impacto dos antibióticos no meio ambiente. Programa Doutoral em Biologia e Ecologia das Alterações Globais