Etude comparative du programme de différenciation terminale de l'épithélium de la cornée normale et des patients atteints de kératocône

The corneal epithelium and epidermis form a complex protective barrier against environmental aggressions. In the epidermis, the terminal differentiation program of keratinocytes is well known and largely provided by the stratum corneum, developed in the final stage of keratinocyte differentiation. In contrast, the differentiation of the corneal epithelial cells is yet poorly studied. Despite that, in some corneal disorders, the first manifestations appear in this tissue. Therefore, further research on the differentiation process of the corneal epithelial cells would significantly improve the early diagnosis and management of patients affected by corneal-related disorders like keratoconus. Keratoconus is a multifactorial corneal ectasia associated with numerous surface changes causing a gradual and irreversible degradation of vision. The aim of my work was to characterize the terminal differentiation program of the corneal epithelium in controls versus patients with keratoconus. Firstly, I analyzed the expression of three groups of genes involved in various steps of the corneal epidermal differentiation: 1) genes that encoded keratins, 2) genes that encoded junctional complex proteins and 3) genes that coded for components of the cornified envelope, a pericellular and highly resistant structure that replaces the plasma membrane of keratinocytes during the last step of their differentiation, by means of RT-qPCR, Western Blot and immunohistology. Previous studies demonstrated that many of these genes were shown to be expressed in the cornea; however no data was available for those encoding corneodesmosin, filaggrin, hornerin and keratins 1/10. In parallel, I investigated the differential expression of the selected genes in the corneal epithelium in two cohorts of keratoconus patients (mild versus severe). I showed that the expression of keratin 16 was absent in the corneas of patients with keratoconus in comparison to controls. In line with this, I discovered that the expression and localization of several genes encoding cornified envelope components (such as involucrin, the Small Proline-Rich Proteins (SPRRs) and proteins of desmosomal plaques) was down-regulated and abnormal, respectively, in keratoconus. Surprisingly, cornified envelopes are not produced by the differentiated corneal epithelial cells. SPRRs have been reported to quench the reactive oxygen species in vitro, therefore we hypothesized that they might play a role in the corneal epithelium. Subsequently, I analyzed the expression of the main genes involved in the NRF2-pathway of oxidative stress protection such as the heme oxygenases 1 and 2, the nuclear factor erythroid 2-related factor 2, the lysyl oxidase, KEAP1, among others. Many of them were under-expressed in the keratoconus cornea epitheliums, finding that supports the involvement of oxidative stress in the progression of the disease. My findings allowed, on one hand, the characterization of the differentiation program of corneal epithelial cells and, on the other hand, the better understanding of the pathophysiology of keratoconus by proposing the involvement of mechanical weakness and a deficit in the oxidative stress response.This could improve the management of the keratoconic patients and may provide new insights for its prevention and treatment in the future.; L'épithélium cornéen, tout comme l'épiderme, forme une barrière complexe qui protège l'organisme contre les agressions de l'environnement. Dans l'épiderme, cette fonction est assurée en grande partie par la couche cornée qui correspond à l'étape finale, de mieux en mieux caractérisée, de la différenciation du kératinocyte. Par contre, le programme de différenciation de l'épithélium de la cornée est peu étudié. Pourtant, les premières manifestations de diverses pathologies cornéennes apparaissent au niveau de l'épithélium, et leur dépistage précoce pourrait modifier notablement leur prise en charge. Cela pourrait être le cas du kératocône, une ectasie cornéenne plurifactorielle et rare, associée à de nombreux remaniements de surface engendrant une dégradation progressive et irréversible de la vision. L'objectif de mon travail de thèse a été de caractériser le programme de différenciation terminale de l'épithélium cornéen en situation normale et dans le cas du kératocône en prenant comme référence les gènes de différenciation tardive de l' épiderme. Tout d'abord, j'ai analysé l'expression de 3 groupes de gènes représentatifs des étapes de la différenciation épidermique (gènes des kératines, des protéines des complexes jonctionnels et des composants de l'enveloppe cornée, une structure péricellulaire résistante qui remplace la membrane plasmique des kératinocytes épidermiques lors de l'étape ultime de leur différenciation) dans l'épithélium cornéen contrôle en utilisant des techniques de RT-qPCR, Western Blot et immunohistologie. J'ai montré que l'épithélium de la cornée exprime un grand nombre des gènes de l'épiderme, mais pas ceux de la cornéodesmosine, la filaggrine, l'hornerine et des kératines 1/10. En parallèle, j'ai recherché les mêmes gènes dans l'épithélium de la cornée de deux cohortes de patients atteints de kératocône. J'ai montré que la kératine 16 est exprimée dans les cornées contrôles et disparaît dans le kératocône. Curieusement, de nombreux gènes codant pour les composants de l'enveloppe cornée sont exprimés dans l'épithélium cornéen comme ceux de l'involucrine, des Small Proline- Rich Proteins (SPRRs) et des protéines de la plaque desmosomale. De plus leur expression diminue dans l'épithélium cornéen kératoconique, avec une localisation subcellulaire différente pour l'involucrine. Pourtant, l'enveloppe cornée n'est pas produite par les cellules épithéliales différenciées de la cornée. Les protéines SPRRs étant aussi impliquées dans la détoxification des espèces réactives de l'oxygène in vitro, nous avons supposé qu'elles jouent ce rôle dans l'épithélium cornéen. Enfin, j'ai complété mes analyses avec l'étude des principaux éléments de la voie NRF2 de protection au stress oxydatif : heme oxygenases 1 et 2, nuclear factor erythroid 2-related factor 2, lysyl oxydase, KEAP1, etc. Plusieurs de ces gènes sont exprimés plus faiblement dans les cornées du kératocône par rapport aux cornées contrôles. Ces résultats ont permis, d'une part, de caractériser le programme de différenciation des cellules épithéliales de la cornée et, d'autre part, de mieux comprendre la physiopathologie du kératocône en proposant l'implication d'un déficit de la réponse au stress oxydatif.