Heterologous expression of a laticifer osmotin and development of protocols to extract the recombinant protein from inclusion bodies

In the previous step to this work, a protein identified as osmotin (CpOsm) was purified from Calotropis procera latex which showed strong antifungal activity. The protein was expressed in prokaryotic and eukaryotic systems, but a suitable protocol for purification has not been achieved. In the present work, from inclusion bodies (IB) obtained from Escherichia coli BL21 (DE3) proceeded to a survey by different solubilization protocols of proteins in an attempt to obtain the recombinant protein (rCpOsm) soluble, and then evaluates it as its activity and finally, exploring new methods for purification. The bacterial culture was induced at different conditions of temperature and time of induction. IB were subjected to chemical treatments with surfactants (CTAB; Cetrimide; ARG-12, a derivative surfactant Argenine) and a denaturing agent (guanidine hydrochloride); physical treatment by sonication and the enzymatic treatment with protease native C. procera latex. Electrophoresis assays suggested that two chemical surfactants were effective in solubilizing rCpOsm while not ARG-12. Although these cationic compounds solubilized rCpOsm more than other proteins of IB, while the sonication process samples produced with a greater variety of soluble proteins including rCpOsm. The enzymatic treatment showed that IB proteins are, in some range, digested while rCpOsm did not. All samples were evaluated for action on Colletotrichum gloeosporiodes after dialysis and lyophilization and showed inhibitory activity of spore germination and mycelial growth. However, it was shown that the activity could be related to the solubilising agents. Insoluble proteins obtained from E. coli containing the plasmid integrity, taken as a negative control showed no activity in these assays. The rCpOsm solubilized by CTAB was subjected to chromatography on Ni ++ column (Ni Sepharose 6 Fast Flow) pH 7.0; in hydrophobic media (FenilSepharose CL-4B) and ion exchange (Resource-S). None of the applied protocols resulted in the purification of rCpOsm and these data repeated what was observed previously for rCpOsm purified from Pichia pastoris. Em etapa anterior a este trabalho, uma proteína identificada como osmotina (CpOsm) foi purificada do látex de Calotropis procera a qual apresentou forte atividade antifúngica. A proteína foi expressa em sistemas procarionte e eucarionte, mas um protocolo adequado para sua purificação não foi alcançado. No presente trabalho, partindo de corpos de inclusão (CI), obtidos de E. coli BL21(DE3) procedeu-se uma prospecção por diferentes protocolos de solubilização de suas proteínas, na tentativa de obter a proteína recombinante (rCpOsm) solúvel, para então avaliá-la quanto a sua atividade e por fim, prospectar novos métodos para sua purificação. A cultura bacteriana foi induzida em diferentes condições de temperatura e tempo de indução. Após 3 horas de indução a 37 °C, 180 rpm, os CI foram lisados e submetidos a tratamentos químicos com surfactantes (CTAB; Cetrimida; ARG-12: um surfactante derivado de argenina) e um agente desnaturante (Cloridrato de Guanidina); tratamento físico por sonicação (4 ciclos de 2,5 min. cada a 50% de potência) e tratamento enzimático com protease nativa do látex de C. procera. Ensaios de eletroforese sugeriram que os dois surfactantes químicos foram eficientes na solubilização de rCpOsm enquanto que ARG-12 não. Ainda, estes compostos catiônicos solubilizaram rCpOsm mais do que as demais proteínas dos CI, enquanto que o processo de sonicação produziu amostras com maior diversidade de proteínas solúveis, incluindo rCpOsm. O tratamento enzimático mostrou que proteínas de CI são, em algum alcance, digeridas enquanto que rCpOsm não. O efeito do tratamento dos CI com protease foi analisado por imagens de microscopia de força atômica e as diferenças de estrutura entre os CI tratados e não tratados documentados. Todas as amostras foram avaliadas quanto à ação sobre Colletotrichum gloeosporiodes após diálise e liofilização. Os produtos dos tratamentos com surfactantes apresentaram atividade antifúngica, demonstrando atividade inibitória de germinação de esporos e crescimento micelial. Entretanto, foi demonstrado que a atividade poderia estar relacionada aos agentes solubilizantes. Proteínas insolúveis obtidas de E. coli contendo o plasmídeo íntegro, tomadas como controle negativo, não apresentaram atividade nestes ensaios. A rCpOsm solubilizada com CTAB foi submetida a cromatografia em coluna de Ni++ (Ni Sepharose 6 Fast Flow) pH 7,0; em meio hidrofóbico (FenilSepharose CL-4B) e troca iônica (Resource-S). Nenhum dos protocolos aplicados resultou na purificação de rCpOsm e estes dados repetem o que foi observado previamente para a rCpOsm purificada a partir de Pichia pastoris.