Polisacáridos y variantes del virus Herpes simplex como herramienta en el esclarecimiento de la patogenia viral

Los carragenanos (CGNs), galactanos sulfatados aislados de algas rojas, han sidoidentificados como potentes inhibidores del virus Herpes simplex tipo 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2) afectando principalmente la adsorción de HSV a la célula, etapa inicial del cicloviral. Dado que presentan una similitud estructural con el heparan sulfato (HS), receptorcelular que media la adsorción de HSV a la célula, actúan bloqueando la interacciónvirus-HS, en la que participan glicoproteínas de la envoltura viral. En estudios previosse seleccionaron y caracterizaron variantes virales sinciciales (syn) de HSV-1 (F) porpasajes sucesivos del virus en células Vero en presencia de un CGN natural 1C3 (deestructura relacionada con CGNs Iota (ι) y Kappa (κ)) con el fin de evaluar la capacidadde los CGNs de generar variantes virales resistentes durante el proceso de selección. Enel presente trabajo se profundizó el estudio de la caracterización citopática y patogénicade las variantes 1C314-1 y 1C317-2. Las variantes mostraron un bajo nivel deresistencia a 1C3, heparina, aciclovir (ACV) y foscarnet (PFA). Las mismas resultaronavirulentas en ratones BALB/c infectados por vía intravaginal respecto de la cepa patrónque mostró alta mortalidad. La atenuación se correlacionó con bajos niveles de04:00 p.m. 22/12/2014citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α, IL-6) en lavados vaginales, aunque el título viralfue similar al obtenido con la cepa patrón. Por vía intranasal las variantes mostraron unamarcada virulencia en ratones BALB/c, conduciendo a una generalizada diseminaciónviral. En ratones C57BL/6 resultaron avirulentas empleando las mismas vías deinfección. Para evaluar la capacidad de generar variantes atenuadas con otro serotipo de HSV empleando la misma estrategia usada con HSV-1, se realizaron pasajes seriados de HSV-2 cepa MS en células Vero en presencia de concentraciones crecientes de CGNs ιy κ. Se seleccionaron 4 clones, ι22-9, ι22-12, κ22-12 y κ22-13, los cuales mostrarontener fenotipo syn, leve resistencia a los CGNs y a la heparina, pero variablesusceptibilidad al ACV y al PFA. Todos los clones fueron menos virulentos que la cepapatrón (100% mortalidad) particularmente para ratones C57BL/6 por inoculaciónintravaginal e intranasal. La atenuación de las variantes de HSV-2 se correlacionó conaltos niveles de TNF-α e IL-6 en lavados vaginales, y la infectividad cuantificada en losmismos fue similar a la obtenida con la cepa parental. Las variantes mostraron unareplicación similar a la cepa parental en células Vero. Sin embargo, en cultivosprimarios de astrocitos murinos mostraron un menor rendimiento viral. Los estudios invitro realizados, mostraron que los CGNs ι y κ estimulan la proliferación celular y laliberación de citoquinas en macrófagos murinos (RAW264.7). Sin embargo, inoculadosen ratones BALB/c por vía intravenosa no lograron elevar los niveles de citoquinasséricas. El conjunto de estos resultados indica que el sistema inmune innato,especialmente en la regulación de los niveles de TNF-α e IL-6, juega un rol deimportancia en la patología del virus herpes simplex y apunta a considerar la posibilidadque este tipo de variantes virales tanto de HSV-1 como de HSV-2 emerjan durante lasterapias antivirales basadas en CGNs. Natural carrageenans (CGNs), extracted from red seaweeds, are well known as potentand selective inhibitors of Herpes Simplex virus type 1 and 2 (HSV-1 and HSV-2). They have a chemical structure similar to heparan sulfate (HS) that serves as a primaryreceptor for adsorption. Their mode of antiviral action is by interference with HSVattachment to cells, blocking the interaction virus-HS, involving viral glycoprotein‟s. Ina previous work, viral variants of HSV-1 were obtained by successive passages on Verocells under selective pressure with the CGN 1C3, (partially cyclized μ/v-carrageenan,related to ι and κ CGNs) in order to test the ability of the carrageenan to generateresistant variants during the selection process. In the present work, a more detailedstudy of the cytopathic and pathogenic behavior of HSV-1 syncytial (syn) variants 1C314-1 and 1C317-2 was carried out. The variants showed low levels of resistance to 1C3, heparin, Aciclovir (ACV), and Foscarnet (PFA). They also showed to be avirulentfor BALB/c mice infected by intravaginal route, although the parental strain F washighly lethal. The attenuation of the variants was correlated with lower levels of proinflammatorycytokines (IL-6 and TNF-α) in vaginal lavages with respect to theparental strain, despite that viral titers were similar between the viral variants and the Fstrain. Nevertheless, the variants were highly lethal for BALB/c mice inoculated by theintranasal route, with a generalized organ spreading. To evaluate the capacity togenerate attenuated variants using another HSV serotype employing the same strategyused before, 22 passages of HSV-2 (MS) were made on Vero cells with increasingamounts of κ or ι carrageenan. As a result of this, four clones were selected and named,ι22-9, ι22-12, κ22-12 and κ22-13. The clones showed a 100% syn phenotype, a mildresistance to CGNs and heparin and a variable susceptibility to ACV and PFA. All theclones were less virulent for mice intravaginal and intranasal inoculated, particularly for C57BL/6 strain, whereas MS strain produced 100% of mortality. In contrast to HSV-1variants, the attenuation was correlated with high levels of pro-inflammatory cytokines (TNF-α y IL-6), on vaginal lavages. The variants of HSV-2 showed that although all ofthem grew equally on Vero cells, a partially restricted phenotype was observed when aprimary culture of mouse astrocytes was employed. Finally, the CGNs were able tostimulate the proliferation of several cells lines and cytokines secretion in vitro but theydid not showed this behavior on BALB/c mice inoculated by intravenous route. Taking all these results together, we can conclude that the innate immune system,specially TNF-α and IL-6 expression, plays an important role in the pathology of herpessimplex virus, and the possibility that this kind of HSV-1 and HSV-2 variants couldemerge during an antiviral therapy for humans based on CGNs, must be considered. Fil: Mateu, Cecilia Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.