Identificación de péptidos penetrantes (aptámeros) de ovocitos de cerdo

Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales. Facultad de Biología. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Facultad de Agrobiología. Facultad de Químico Farmacobiología. Programa Institucional de Maestría en Ciencias Biológicas Cellular penetrating peptides (CPPs) belong to a new class of delivery vectors for different molecules. They are classified by their physicochemical properties into cationic, hydrophobic and amphipathic. According to their origin they can be natural, chimeric or synthetic. CPPs can bind different molecules (charges), such as imaging agents, drugs, proteins, DNA, and RNA. Some proposed mechanisms for cellular uptake of CPP are direct translocation, endocytosis, and translocation through the formation of a membrane structure.This depends on factors such as the method of binding the charge to the CPPs, temperature and pH. In the present work, CPPs that were found in the viral library Ph.D.-Phage Display, which have 10? combinations of 12 amino acid peptides, were isolated. The objective was to identify and isolate peptides capable of translocating to the pig oocyte cell membrane. Five experiments were performed independently, plus three rounds of selection (bioppaning) for each. Pig oocytes without membranes such as the granulosa layer and the pellucid zone were used. Each round of selection, to isolate the CPPs, consisted of incubating the viral library with the oocytes (15-20 in each selection), then the virus was eliminated in a first step by cell washes and finally by treatment of the oocytes with trypsin. The cell lysate was amplified in E. coli 2738 K12 and a viral plaque was performed to verify the existence of bacteriophages. From this experiment, the second round of selection was carried out and finally, from the second round of selection, the third round was carried out. Los péptidos penetrantes celulares (CPP) pertenecen a una nueva clase de vectores de administración de diferentes moléculas. Se clasifican por sus propiedades fisicoquímicas en catiónicos, hidrofóbicos y anfipáticos. De acuerdo con su origen pueden se naturales, quimérico o sintéticos. A los CPP se les puede unir diferentes moléculas (cargos), tales como agentes de imagen, cargas biológicas, drogas, proteínas, ADN y ARN. Algunos mecanismos propuestos para la captación celular de los CPP son, la translocación directa, endocitosis y translocación a través de la formación de una estructura de membrana. Lo anterior depende de factores, tales como, el método de unión del cargo al CPP, la temperatura y el pH. En el presente trabajo se aislaron CPP que se encuentran en la biblioteca viral Ph.D.-Phage Display, la cual posee 10? combinaciones de péptidos de 12 aminoácidos. El objetivo fue identificar y aislar los péptidos capaces de translocarse a la membrana celular del ovocito de cerdo. Se realizaron cinco experimentos de manera independiente, además de tres rondas de selección (bioppaning) para cada uno. Se utilizaron ovocitos de cerdo sin membranas tales como la capa de la granulosa y la zona pelúcida. Cada ronda de selección, para aislar a los CPP, consistió en incubar la biblioteca viral con los ovocitos (15-20 en cada selección) posteriormente se eliminó el virus en un primer paso por lavados celulares y finalmente por tratamiento de los ovocitos con tripsina. Se amplificó el lisado celular en E. coli 2738 K12 y se realizó un plaqueo viral para comprobar la existencia de bacteriófagos. A partir de dicho experimento se realizó la segunda ronda de selección y finalmente a partir de la segunda ronda de selección se realizó la tercera.