Produção heteróloga, purificação, caracterização funcional e predição estrutural do carregador mitochondrial de piruvato humano

Orientador: Andre Luis Berteli Ambrosio Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia. Resumo: O piruvato é considerado o ponto central do metabolismo celular, chave para a geração de energia e blocos biossintéticos. Quando a oxidação do piruvato pelo ciclo do ácido cítrico é necessária, o piruvato citosólico deve ganhar acesso à matriz mitocondrial em um processo que se acredita envolver ativamente duas subunidades carreadoras de piruvato mitocondrial (MPC) organizadas em hetero-oligômeros. Desde 2012, quando as identidades moleculares de mamíferos MPC1 e MPC2 (e MPC3 em leveduras) foram finalmente apresentadas, vários estudos in vitro e in vivo revelaram uma interação inesperada entre duas ou mesmo três subunidades de proteínas que definem diferentes conjuntos funcionais, em um contexto metabólicos específicos; estes têm implicações claras na fisiologia da homeostase e em algumas doenças. No entanto, o mecanismo funcional baseado em estrutura de MPC permanece indefinido, apesar dos intensos esforços empregando ferramentas computacionais e técnicas experimentais de última geração. Nesta tese, a produção recombinante de MPC humano, através de uma estratégia de co-expressão, é incialmente descrita; no entanto, não foi observada formação substancial de complexos e, predominantemente, subunidades individuais foram purificadas. Em contraste com MPC1, que co-purifica com uma chaperona de levedura, demonstramos que os homo-oligômeros MPC2 promovem o transporte eficiente do piruvato em proteolipossomos. Os requisitos funcionais derivados e as características cinéticas do MPC2 assemelham-se aos demonstrados anteriormente para o MPC na literatura. De maneira distinta, a inibição química do transporte é observada apenas para um derivado de tiazolidinediona. O papel de transporte autônomo para MPC2 é validado em células, quando a expressão ectópica de MPC2 humano em levedura sem MPC endógeno estimulou o crescimento e aumentou o consumo de oxigênio celular. A detecção de várias espécies oligoméricas de MPC2 em isolados mitocondriais, proteínas purificadas e bicamadas lipídicas artificiais sugerem complexos funcionais de alta ordem (> 2 subunidades). Mudanças significativas no conteúdo da estrutura secundária de MPC2, conforme sondado por dicroísmo circular de radiação sincrotron, suportam ainda mais a interação entre a proteína e os ligantes. A cristalografia de raios X foi prejudicada pela incapacidade de se obter cristais adequados tanto, por difusão de vapor, quanto em fase cúbica lipídica, apesar da obtenção de condições iniciais promissoras. Por fim, a análise por crio-microscopia eletrônica de MPC2 reconstituído em nanodiscos de copolímeros sintéticos permitiu a proposição de uma montagem estequiométrica para o complexo. Coletivamente, nossos resultados fornecem bases para o papel independente do MPC2 na homeostase e doenças relacionadas ao metabolismo desregulado do piruvato e representam uma rota promissora para a determinação de um modelo atômico de alta resolução para MPC2 humano. Abstract: Pyruvate is considered the central hub in the cellular metabolism, key for the generation of both energy and biosynthetic blocks. When the oxidation of pyruvate by the citric acid cycle is required, cytosolic pyruvate must gain access to the mitochondrial matrix in a process thought to actively involve two mitochondrial pyruvate carrier (MPC) subunits assembled into heterotypic oligomers. Since 2012, when molecular identities of mammalian MPC1 and MPC2 (and MPC3 in yeast) were presented, range of in vitro and in vivo studies has since revealed an unexpected interplay between two or even three protein subunits that define different functional assemblies on a metabolic context-specific basis; these have clear implications on the physiology of homeostasis and diseases. However, the structure-based functional mechanism of MPC remains elusive, despite intensive efforts by different research groups that employ state-of-the-art computational tools and experimental techniques. In this thesis, the recombinant production of human MPC through a co-expression strategy is first described; nevertheless, substantial complex formation was not observed, and predominantly individual subunits were purified. In contrast to MPC1, which co-purifies with a host chaperone, we demonstrated that MPC2 homo-oligomers promote efficient pyruvate transport into proteoliposomes. The derived functional requirements and kinetic features of MPC2 resemble those previously demonstrated for MPC in the literature. Distinctly, chemical inhibition of transport is observed only for a thiazolidinedione derivative. The autonomous transport role for MPC2 is validated in cells when the ectopic expression of human MPC2 in yeast lacking endogenous MPC stimulated growth and increased oxygen consumption. Multiple oligomeric species of MPC2 across mitochondrial isolates, purified protein and artificial lipid bilayers suggest functional high-order complexes. Significant changes in the secondary structure content of MPC2, as probed by synchrotron radiation circular dichroism, further supports the interaction between the protein and ligands. X-ray crystallography was hampered by the inability to grow suitable crystals by vapor diffusion and in lipidic cubic phase, despite the successful obtention of promising hit conditions. Lastly, cryo-electron microscopy analysis of MPC2 reconstituted into synthetic copolymer nanodiscs allowed for the proposition of a stoichiometric assembly. Collectively, our results provide the initial framework for the independent role of MPC2 in homeostasis and diseases related to dysregulated pyruvate metabolism and may represent a promising route for the determination of a high-resolution atomic model for human MPC2. Doutorado Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde Doutor em Ciências CAPES 001 FAPESP 2015/02734-7; 2019/02261-2