Expressão heteróloga de duas lipases em Komagataella phaffii utilizando promotores constitutivos

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). A levedura metilotrófica Komagataella phaffii destaca-se como sistema de expressão de proteínas recombinantes por ser capaz de produzir e secretar grandes quantidades de proteínas em altas densidades celulares, além de realizar modificações pós-traducionais típicas de eucariotos, o que a torna ideal para a produção de biocatalisadores industriais. Atualmente, os promotores constitutivos de K. phaffii têm sido pesquisados e testados devido ao interesse na capacidade de transcrição contínua do gene alvo em todas fases de crescimento do microrganismo. Os promotores constitutivos PGAP e PTEF1, que controlam a expressão dos genes codificadores da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase e do fator de elongação da tradução, respectivamente, são considerados eficientes na produção de proteína heteróloga em K. phaffii. As lipases são uma classe de enzimas com aplicações na indústria de alimentos, na indústria têxtil, farmacêutica, cosmética, na produção de biodiesel e detergentes, dentre outros. Entre as lipases mais importantes de uso industrial, destacam-se as lipases de Rhizomucur miehei (RML) e de Pseudozyma antarctica (lipase B/CALB). No presente trabalho, foram construídos novos vetores integrativos com expressão baseada nos promotores PGAP e PTEF1, com o estabelecimento de uma metodologia de clonagem in vivo em E. coli, que não necessita do uso de enzimas e reagentes específicos. As construções plasmidiais foram usadas para transformar levedura. Foi obtida a produção de RML dirigida pelo promotor PTEF1 pela primeira vez em K. phaffii, e a CALB foi expressa sob controle dos promotores PGAP e PTEF1. A enzima CALB foi identificada em SDS-PAGE desnaturante como uma banda de aproximadamente 37 kDa presente no sobrenadante e confirmada como lipase em zimograma utilizando o substrato MUF-butirato. Em relação aos ensaios de atividade enzimática nas condições testadas, não foi observada diferença significativa na produção de CALB pelos diferentes promotores. The methylotrophic yeast Komagataella phaffii stands out as a recombinant protein expression system by being able to produce and secrete large amounts of proteins at high cell densities, in addition to performing post-translational modifications typical of eukaryotes, which makes it ideal for production of industrial biocatalysts. Currently, constitutives promoters of K. phaffii have been researched and tested because of the interest in its ability to perform the transcription of the target gene at all stages of the growth of the microorganism. The constitutives promoters PGAP and PTEF1, which control the genes of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase and the elongation factor of the translation, respectively, are considered efficient in the production of heterologous protein in K. phaffii. Lipases are a class of enzymes with applications in the food industry, the textile industry, pharmaceuticals, cosmetics, in the production of biodiesel and detergents, among others. Among the most important lipases for industrial use, the lipases of Rhizomucur miehei (RML) and lipase B of Pseudozyma antarctica (CALB) stand out. In the present work new integrative vectors were constructed with their expression based on the TEF1 and GAP promoters establishing an in vivo cloning methodology in E. coli, which does not require the use of enzymes and specific reagents. The plasmids constructed were used to transform yeasts. The production of the Rhizomucur miehei lipase was drove by the PTEF1 promoter for the first time in K. phaffii, and the Pseudozyma antarctica lipase was expressed under the control of PGAP and PTEF1. The CALB enzyme was identified on denaturing SDS-PAGE as a band of approximately 37 kDa and confirmed as lipase in zygogram using the MUF-butyrate substrate. In relation to the enzymatic assays performed, under the tested conditions, no significant difference in CALB production was observed by the different promoters.